田曉剛， 趙 林， 張春林， 任錦霞， 趙鳳菊， 楊文翠， 茍彩霞

(甘肅省腫瘤醫(yī)院放療一病區(qū)， 甘肅 蘭州 730050)

放射治療(放療)是現(xiàn)階段腫瘤輔助治療的重要手段之一，隨著放療技術(shù)不斷進(jìn)步，近年來腫瘤放療的效果取得了一定的改善，但是胃癌患者大多對(duì)放射治療不敏感，這一特點(diǎn)限制了放射治療在胃癌中的應(yīng)用[1-2]。為了減少胃癌放射治療的應(yīng)用局限、提高胃癌放射治療的療效，有必要進(jìn)行胃癌細(xì)胞的放射增敏研究。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一類長(zhǎng)度為18～21 nt的非編碼RNA，具有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的作用。大量研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程伴隨著miRNA的水平變化，并影響腫瘤的放療或化療效果[3-4]。前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-126在對(duì)放化綜合治療不敏感的患者胃癌組織中存在低表達(dá)，而提高胃癌SGC-7901細(xì)胞中的miR-126水平后，該細(xì)胞對(duì)放射治療的敏感性增強(qiáng)[5]。生物信息學(xué)證據(jù)提示zeste基因增強(qiáng)子同源物2(enhancer ofzestehomolog 2，EZH2)基因是miR-126潛在的靶基因，且既往研究表明EZH2參與腫瘤細(xì)胞對(duì)放射治療的敏感性[6]。因此，本研究假設(shè)miR-126可能通過靶向抑制EZH2在胃癌細(xì)胞中發(fā)揮放射增敏作用并設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

TRIzol總RNA提取試劑盒購自Thermo Fisher Scientific； PrimeScript?RTase反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物(大連)工程有限公司； TaqMan? MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Life Technologies； microRNA熒光定量 PCR 試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司； GoTaq?實(shí)時(shí)熒光定量qPCR 試劑盒、Dual-Glo?雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒及相關(guān)報(bào)告質(zhì)粒購自北京普洛麥格生物有限公司；所有引物、真核表達(dá)質(zhì)粒、miRNA模擬序列及用于轉(zhuǎn)染對(duì)照的無關(guān)序列均由上海吉瑪生物有限公司設(shè)計(jì)合成; DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶和Lipofectamine系列轉(zhuǎn)染試劑購自Thermo Fisher Scientific； CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天公司； Annexin V-FITC凋亡試劑盒購自Sigma；所有 I 抗及 II 抗購自Abcam； ECL超敏發(fā)光液購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌SGC-7901細(xì)胞系購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞消化使用0.25%胰酶,培養(yǎng)條件為37℃、 5%CO2濕度恒定的細(xì)胞培養(yǎng)箱。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 通過轉(zhuǎn)染miR-126 模擬序列(miR-126 mimic, 5’-UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG-3’)使SGC-7901細(xì)胞中miR-126過表達(dá)。通過轉(zhuǎn)染EZH2真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-EZH2使SGC-7901細(xì)胞中EZH2過表達(dá)。miR-126 mimic的轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine? RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑，同時(shí)轉(zhuǎn)染miRNA陰性對(duì)照序列(miRNA negative control, miR-NC)作為陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照。真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-EZH2的轉(zhuǎn)染使用Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑，同時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒作為陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照。具體轉(zhuǎn)染方案參考轉(zhuǎn)染試劑廠商提供的說明書。

2.3RT-qPCR TRIzol試劑提取細(xì)胞中的總RNA樣本，提取的RNA樣本經(jīng)定量和純度檢測(cè)后(A260/A280值位于1.8～2.0間)用于反轉(zhuǎn)錄。為進(jìn)行miR-126的檢測(cè)，RNA反轉(zhuǎn)錄采用TaqMan? MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑試劑盒進(jìn)行以合成cDNA，合成的cDNA采用miRNA熒光定量 PCR 試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增定量。為進(jìn)行EZH2的mRNA檢測(cè)，RNA的反轉(zhuǎn)錄采用PrimeScript?RTase反轉(zhuǎn)錄試劑盒以合成cDNA，合成的cDNA采用GoTaq?實(shí)時(shí)熒光定量 qPCR 試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增定量。所有PCR反應(yīng)條件參考廠商提供的說明書。miR-126的定量采用小核仁RNA 48 (small nucleolar RNA 48, SNORD48)作為內(nèi)參照，EZH2的mRNA定量采用GAPDH作為內(nèi)參照。目的基因的相對(duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCt法計(jì)算。miR-126上游引物序列為5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’，下游采用通用引物，序列為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。SNORD48上游引物序列為5’-GAGTGATGATGACCCCAGGTAA-3’，下游采用通用引物，序列同上。EZH2的上游引物序列為5’-TTTCCAACACAAGTCATCCC-3’，下游引物序列為5’-AACCCACATTCTCTATCCCC-3’。GAPDH上游引物序列為5’-TATAAATTGAGCCCGCAGCC-3’,下游引物序列為5’-TACGACCAAATCCGTTGACTC-3’。

2.4Werstern blot實(shí)驗(yàn) 含有蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液裂解細(xì)胞，收集總蛋白樣品并與上樣緩沖液混合后煮沸,電泳使用12% SDS-PAGE進(jìn)行分離，每孔上樣量25 μg，120 V恒壓電泳。轉(zhuǎn)膜采用PVDF膜，轉(zhuǎn)膜電壓90 V，持續(xù)1.5 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，使用5%脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜1 h。封閉后，膜分別使用兔抗人EZH2多克隆抗體(1∶500)及兔抗人GAPDH多克隆抗體(1∶5 000)4℃孵育過夜。接著使用PBST洗滌3次，除去未結(jié)合的 I 抗;辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II 抗稀釋后(1∶1 000)與膜接觸，室溫下孵育1～2 h，ECL超敏發(fā)光液顯色并分析條帶。

2.5雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 為明確miR-126與EZH2 mRNA的直接靶向關(guān)系，分別設(shè)計(jì)合成含有miR-126結(jié)合位點(diǎn)的野生型及突變型的EZH2 mRNA 3’端非翻譯區(qū)(untranslated region,UTR)序列并克隆至psiCHECK2報(bào)告基因質(zhì)粒，分別命名為psiCHECK2-EZH2-WT及psiCHECK2-EZH2-MUT。將報(bào)告基因質(zhì)粒分別與miR-126 mimic和miR-NC共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞以每孔1×105的密度種植于96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，采用Dual-Glo?雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)分析并計(jì)算螢火蟲螢光素與海腎螢光素發(fā)光強(qiáng)度的比值。

2.6照射處理及分組方式 細(xì)胞接受照射前，按下述分組方案進(jìn)行不同轉(zhuǎn)染處理。根據(jù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染方案的區(qū)別將細(xì)胞分為如下4組：轉(zhuǎn)染miR-126 模擬序列+轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒(miR-126 mimic+pcDNA3.1)組；轉(zhuǎn)染miR-126 模擬序列+轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EZH2表達(dá)質(zhì)粒(miR-126 mimic+pcDNA3.1-EZH2)組；轉(zhuǎn)染microRNA模擬物陰性對(duì)照序列+轉(zhuǎn)染-EZH2表達(dá)質(zhì)粒(miR-NC+pcDNA3.1-EZH2)組；轉(zhuǎn)染miRNA模擬物陰性對(duì)照序列+轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒(miR-NC+pcDNA3.1)組。完成轉(zhuǎn)染48 h后，對(duì)各種轉(zhuǎn)染組合的細(xì)胞進(jìn)行射線照射，照射時(shí)培養(yǎng)皿覆蓋2 cm厚有機(jī)玻璃板，源皮距設(shè)置為100 cm，劑量率為3.2 Gy/min，總劑量為4.0 Gy。

2.7平板集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的放射生物學(xué)參數(shù) 各組細(xì)胞分別接受于0、 2、4及8 Gy劑量的照射，照射后的細(xì)胞接種于6孔板。接種數(shù)量通過照射劑量決定, 0、 2、4及8 Gy劑量對(duì)應(yīng)的接種數(shù)分別為每孔200、 500、2 000及20 000個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)2周后，使用吉姆薩染色估計(jì)集落的形成情況，按公式計(jì)算集落形成率。集落形成率(%)=0 Gy培養(yǎng)皿中的集落數(shù)/0 Gy細(xì)胞培養(yǎng)皿中的細(xì)胞接種數(shù)×100%。按公式計(jì)算細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(survival fraction,SF)。SF=某劑量照射后的培養(yǎng)皿內(nèi)的集落數(shù)/(該劑量的接種數(shù)×集落形成率)。根據(jù)多靶單擊模型計(jì)算各組平均致死量(D0)、2 Gy劑量下對(duì)應(yīng)的SF值(SF2)和放射增敏比(sensitivity enhancement ratio,SER)。SER=(其它組的D0)/(miR-NC+pcDNA3.1組的D0)。

2.8CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 各組細(xì)胞以每孔3×104的密度種植于12孔板。使用CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的活力變化。檢測(cè)時(shí)點(diǎn)為照射后24 h及48 h。檢測(cè)方案參考試劑盒說明書。根據(jù)公式計(jì)算各組細(xì)胞的相對(duì)抑制率。48 h相對(duì)抑制率(%)=1-(48 h細(xì)胞活力值-空白值)/(24 h細(xì)胞活力值-空白值)。

2.9流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 常規(guī)消化各組細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，并使用Annexin V-FITC凋亡試劑盒進(jìn)行染色，避光孵育30 min上機(jī)檢測(cè)并計(jì)算凋亡率。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間差異的比較使用t檢驗(yàn)，多組間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 上調(diào)胃癌SGC-7901細(xì)胞中miR-126可以靶向抑制EZH2的表達(dá)

如圖1 所示，轉(zhuǎn)染miR-126模擬序列可以有效上調(diào)SGC-7901細(xì)胞中的miR-126表達(dá)(P<0.05)。與陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照相比，上調(diào)miR-126后，細(xì)胞中EZH2的mRNA及蛋白水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2、3。

Figure 1. The expression level of miR-126 in the SGC-7901 cells after miR-126 mimic transfection. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-NC group.

Figure 2. The mRNA level of EZH2 in the SGC-7901 after miR-126 mimic transfection. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-NC group.

Figure 3. The protein level of EZH2 in the SGC-7901 cells after miR-126 mimic transfection. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-NC group.

雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，含有EZH2野生型3’UTR 序列的報(bào)告基因質(zhì)粒與miR-126 mimic共轉(zhuǎn)染后，螢光素酶相對(duì)活性降低，明顯低于與miR-NC共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(P<0.05);而含有EZH2突變型3’UTR 序列的報(bào)告基因質(zhì)粒無論與miR-126 mimic還是miR-NC共轉(zhuǎn)染，螢光素酶的相對(duì)活性均無顯著變化。這些證據(jù)表明在胃癌SGC-7901細(xì)胞中miR-126可以直接結(jié)合EZH2 3’UTR的形式靶向抑制EZH2的表達(dá)，見圖4。

Figure 4. The relative luciferase activity of SGC-7901 cells in each group detected by dual-luciferase reporter assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-NC group.

2 miR-126增加胃癌SGC-7901細(xì)胞放射敏感性的作用與EZH2部分介導(dǎo)有關(guān)

集落形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在上調(diào)miR-126水平增加的同時(shí)上調(diào)EZH2水平，會(huì)削弱miR-126的放射增敏作用,見圖5。在放射學(xué)參數(shù)方面，轉(zhuǎn)染miR-126 mimic+pcDNA3.1-EZH2的SF2值及D0值均大于轉(zhuǎn)染miR-126 mimic+pcDNA3.1的細(xì)胞(P<0.05)，其SER小于轉(zhuǎn)染miR-126 mimic+pcDNA3.1的細(xì)胞(P<0.05)，但仍高于其它2組細(xì)胞(P<0.05)，提示EZH2部分逆轉(zhuǎn)了miR-126的放射增敏效果，見表1。在細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染miR-126 mimic+pcDNA3.1-EZH2的細(xì)胞在經(jīng)過照射后生長(zhǎng)抑制率低于轉(zhuǎn)染miR-126 mimic+pcDNA3.1的細(xì)胞(P<0.05)，但仍高于其它2組細(xì)胞(P<0.05)，見圖6。細(xì)胞凋亡分析結(jié)果可見，轉(zhuǎn)染miR-126 mimic+pcDNA3.1-EZH2的細(xì)胞在經(jīng)過照射后凋亡率低于轉(zhuǎn)染miR-126 mimic+pcDNA3.1的細(xì)胞(P<0.05)，但仍高于其它2組細(xì)胞(P<0.05)，見圖7。僅上調(diào)EZH2的細(xì)胞(miR-NC+pcDNA3.1-EZH2組)與陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照細(xì)胞(miR-NC+pcDNA3.1組)相比，照射后的細(xì)胞活力及凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。這些證據(jù)提示miR-126增強(qiáng)胃癌SGC-7901細(xì)胞放射敏感性的作用與EZH2有關(guān)，但這種關(guān)系只是部分的。

討 論

大多數(shù)腫瘤細(xì)胞都存在一定的放射耐受現(xiàn)象，臨床上放射野內(nèi)的腫瘤出現(xiàn)復(fù)發(fā)的現(xiàn)象依舊存在[7-8]。胃癌的病理分型以腺癌為主，而腺癌對(duì)放射線相對(duì)不敏感，加之胃周圍鄰近的重要器官等對(duì)放射線耐受性較低，容易引起放射損傷[9]。故單純依靠加大放射劑量取得效果的方式并不可取。這種情況下，需要研究新的放射增敏手段，以提高胃癌細(xì)胞對(duì)放射的敏感性。

miRNA為短鏈非編碼RNA，通過與靶基因特定區(qū)域的結(jié)合可以降解靶基因，從而使靶基因的表達(dá)降低，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。通過這種調(diào)控作用miRNA可與靶基因形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而影響細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)[10]。由于miRNA可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞的DNA修復(fù)、周期以及凋亡等與放射敏感性相關(guān)的重要生物學(xué)環(huán)節(jié)，越來越多的研究開始關(guān)注miRNA與腫瘤細(xì)胞放射敏感性的關(guān)系。有研究指出，食管癌細(xì)胞的放射抵抗現(xiàn)象可能由miR-21引起，抑制miR-21后食管癌細(xì)胞的放射敏感性得到增強(qiáng)[11]。本研究關(guān)注的miR-126已經(jīng)被證實(shí)與多種腫瘤相關(guān)，目前研究?jī)A向于認(rèn)為miR-126不足與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)miR-126在胃癌組織中存在低表達(dá)，與胃癌的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移及侵襲相關(guān)[12]。但是較少有研究探討miR-126與腫瘤放射敏感性的關(guān)系，尚未見到關(guān)于胃癌的相關(guān)報(bào)道。本課題組在前期研究中對(duì)miR-126與胃癌細(xì)胞對(duì)放射敏感性的關(guān)系進(jìn)行了探討。前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)與對(duì)放療較為敏感的胃癌患者相比，對(duì)放療不敏感的患者miR-126水平較低;進(jìn)一步的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-126確實(shí)能增加胃癌細(xì)胞的放射敏感性;但是在之前的研 究中，我們沒能揭示其機(jī)制[5]。本研究在原有研究的基礎(chǔ)上，對(duì)miR-126增強(qiáng)胃癌細(xì)胞放射敏感性的機(jī)制進(jìn)行了探討。我們認(rèn)為miR-126必然通過其靶基因發(fā)揮作用，因此采用生物信息學(xué)手段對(duì)miR-126的靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并對(duì)這些靶基因進(jìn)行了基因注釋分析及KEGG信號(hào)通路分析，據(jù)此選取了部分與腫瘤及腫瘤細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)的靶基因。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，最終在眾多靶基因中選擇了EZH2作為研究對(duì)象。

Figure 5. The colony formation ability of the SGC-7901 cells in each group after 2 Gy radiation. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsother groups.

表1 各組SGC-7901細(xì)胞的放射生物學(xué)參數(shù)的比較

*P<0.05vsother groups.

Figure 6. The changes of the viability of the SGC-7901 cells with different transfection objects after radiation. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsother groups.

EZH2為多梳蛋白家族的主要成員之一，是組蛋白H3第 27 位賴氨酸(H3K27)的特異性甲基化轉(zhuǎn)移酶，參與組蛋白H3的甲基化調(diào)控，對(duì)基因沉默和轉(zhuǎn)錄抑制發(fā)揮重要作用[13]。大量研究證實(shí)，EZH2與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，張笑添等[14]發(fā)現(xiàn)胃癌中miR-101可以通過抑制EZH2減少胃癌細(xì)胞的增殖。更重要的是EZH2與腫瘤細(xì)胞的異常增殖、凋亡減少及周期異常的關(guān)系特別密切，因此,EZH2常常介導(dǎo)腫瘤的治療耐受。如有研究指出EZH2參與卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌的順鉑耐藥，抑制EZH2后，這些腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性均得到提高[15]。在T淋巴細(xì)胞瘤中，抑制EZH2可增加腫瘤細(xì)胞的放射敏感性[16]?；贓ZH2的這種特性，我們假設(shè)miR-126增強(qiáng)胃癌放射敏感性的作用可能是通過對(duì)EZH2的靶向抑制實(shí)現(xiàn)的。為證明此假設(shè)，我們首先在胃癌SG-7901細(xì)胞中驗(yàn)證了miR-126對(duì)EZH2的靶向抑制作用,通過上調(diào)細(xì)胞的miR-126我們觀察到了EZH2的明顯抑制。雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)也提示，miR-126可與EZH2的mRNA 3’UTR區(qū)域結(jié)合。因此我們認(rèn)為在胃癌SG-7901細(xì)胞中，miR-126可以靶向抑制EZH2的表達(dá)。我們進(jìn)一步通過一定的轉(zhuǎn)染組合及隨后的細(xì)胞活性、細(xì)胞凋亡分析發(fā)現(xiàn)，EZH2的過表達(dá)可以削弱miR-126的放射增敏作用，但是這種削弱是部分的，因?yàn)橄鄬?duì)陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照細(xì)胞，即使過表達(dá)EZH2，miR-126過表達(dá)的細(xì)胞仍然對(duì)放射較為敏感。這表明miR-126確實(shí)通過抑制EZH2來增加胃癌細(xì)胞對(duì)射線的敏感，但不是僅通過EZH2，必定有其它miR-126的靶基因參與此過程，這值得在后續(xù)研究中去探討。另外，我們發(fā)現(xiàn)，在單純上調(diào)EZH2的情況下，細(xì)胞的放射敏感性并沒有降低，這說明在SGC-7901細(xì)胞中EZH2的作用可能已經(jīng)飽和，故即使過表達(dá)EZH2也無法誘導(dǎo)進(jìn)一步的放射抵抗。

Figure 7. The apoptotic rates in the SGC-7901 cells with diffe-rent transfection objects after radiation. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsother groups.

總之，本研究初步證實(shí)miR-126可通過EZH2的靶向抑制而增強(qiáng)胃癌細(xì)胞放射敏感性。