張國燕， 李志凌， 曹 珅， 彭 嬋， 盧 玥， 牛 杰， 席卓青， 張怡丹， 方 東， 謝松強

(河南大學藥學院， 河南 開封 475004)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，腫瘤轉(zhuǎn)移則是導致乳腺癌患者死亡的主要原因[1]。在抗腫瘤新藥研發(fā)中蛋白激酶B(protein kinase B, PKB; 又稱AKT)小分子抑制劑已受到關注，然而有研究發(fā)現(xiàn)抑制AKT1的功能反而促進乳腺癌的轉(zhuǎn)移[2-3]。但目前為止，AKT1負性調(diào)控乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機制還不清楚。

β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是一種分子量約92 kD 的多功能蛋白質(zhì)。正常情況下，細胞內(nèi)僅存在極少量的β-catenin，在細胞連接處作為一種細胞骨架蛋白參與細胞間的黏附，維持上皮的極性及完整性[4-5]。在異常情況下，細胞質(zhì)中β-catenin蛋白的表達則會明顯上調(diào)，過多的β-catenin 則可進入細胞核，啟動基質(zhì)金屬蛋白酶等腫瘤轉(zhuǎn)移相關基因的轉(zhuǎn)錄和表達[6-7]。但β-catenin核轉(zhuǎn)位是否參與AKT1 負性調(diào)控乳腺癌轉(zhuǎn)移還不清楚，本研究擬探究β-catenin的核轉(zhuǎn)位是否參與了AKT1負性調(diào)控乳腺癌細胞的遷移。

材 料 和 方 法

1 細胞和試劑

人乳腺癌細胞株MCF-7 和MDA-MB-231均購自中國科學院細胞庫。RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自四季青公司；二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、Hoechst 33342染料和XAV-939購自Sigma；免抗人β-catenin多克隆抗體、鼠抗人AKT1和β-actin單克隆抗體、鼠抗人lamin B1多克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的 II 抗購自Santa Cruz； Alexa Fluor 488標記的熒光 II 抗購自Invitrogen；AKT1小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)購自Dharmacon，2條siRNA序列分別為5’-ACAAGGACGGGCACATTAA-3’(1#siAKT1)和5’-CAAGGGCACTTTCGGCAAG-3’(2#siAKT1)。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng)與RNA干擾 細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、青霉素(1×105U/L)和鏈霉素(100 mg/L)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于含5% CO2、 37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育。當細胞密度達到70%時，參照Lipofectamine 2000說明書轉(zhuǎn)染AKT1 siRNA, 轉(zhuǎn)染24 h后進行后續(xù)實驗。

2.2Western blot實驗檢測β-catenin總蛋白和核蛋白的表達 用RIPA(碧云天)裂解液提取腫瘤細胞的總蛋白，使用細胞核蛋白和細胞質(zhì)蛋白提取試劑盒(碧云天)分離出核蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的濃度是由BCA測定試劑盒(Pierce)測定。樣品在95 ℃、 5×SDS-PAGE緩沖液中變性5 min。等量的蛋白使用10%的SDS-PAGE分離。然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶在室溫下封閉1 h。封閉之后，使用抗β-catenin和β-actin抗體在4 ℃下孵化過夜。用TBST洗過3次后，室溫下用辣根過氧化物酶標記的 II 抗孵育1 h，采用ECL試劑盒顯色檢測。

2.3免疫熒光實驗檢測β-catenin蛋白的表達及定位 在小室玻片中以低密度接種的細胞用AKT1 siRNA處理24 h。在室溫下，用4%多聚甲醛固定細胞10 min，然后用PBS洗5 min，5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，4 ℃孵育抗β-catenin抗體 (1∶1 000) 過夜，然后用PBS 洗滌3 次，室溫孵育Alexa Fluor 488標記的熒光 II 抗1 h，采用Hoechst 33342在室溫下標記細胞核5 min，再用PBS 洗滌3 次，激光共聚焦顯微鏡拍照。

2.4Transwell實驗檢測乳腺癌細胞的遷移能力 遷移實驗是在以碳酸酯膜(Corning)為材料，孔徑為8 μm的24孔板里進行的。將對數(shù)生長期的乳腺癌細胞系經(jīng)胰酶消化后用不含血清的培養(yǎng)基制成1×108/L 的單細胞懸液，接種200 μL 至Transwell小室上室，在Transwell小室的下室中加入600 μL 含10% FBS 的培養(yǎng)基，然后在上室轉(zhuǎn)染AKT1 siRNA，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h 后拿出小室，用棉簽擦去上室細胞，用4%的多聚甲醛固定小室膜下的細胞10 min，用含0.1%的結(jié)晶紫甲醇溶液染色20 min 后，PBS 洗3次，風干，然后在光學顯微鏡下計數(shù)。

3 統(tǒng)計學分析

用GraphPad Prism 5軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)都以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。多組間使用單因素方差分析；對于多組間多重比較，進行方差分析后各組均數(shù)間的兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 敲減AKT1表達對β-catenin總蛋白表達的影響

MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞分別轉(zhuǎn)染2條AKT1 siRNA (20 nmol/L) 24 h后，AKT1蛋白的表達均明顯下調(diào)(P<0.01),見圖1，并且β-catenin總蛋白的表達顯著增加(P<0.05，P<0.01)，見圖2。

2 敲減AKT1表達對乳腺癌細胞中β-catenin核蛋白的影響

當敲減MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞中AKT1的表達后，細胞核中β-catenin蛋白的表達顯著增加(P<0.01)，見圖3。免疫熒光實驗也顯示，當敲減AKT1表達后，MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞中的β-catenin熒光染色明顯增強，β-catenin蛋白會在細胞核中集聚，見圖4。

3 β-catenin蛋白的核積聚對乳腺癌細胞遷移能力的影響

當敲減AKT1表達后，MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞的遷移能力明顯增強，而端錨聚合酶抑制劑XAV-939可以明顯逆轉(zhuǎn)敲減AKT1表達誘導的乳腺癌遷移能力的增強(P<0.01)，見圖5。

討 論

AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其家族成員主要有3個，分別是AKT1、AKT2和AKT3，其基因分別定位于人染色體的14q32、19q13和1q44區(qū)域[8]。這3個成員結(jié)構(gòu)相似，在蛋白一級結(jié)構(gòu)上具有80%以上的同源性。大量文獻顯示AKT在肝癌、乳腺癌以及甲狀腺癌等多種惡性腫瘤中以異?；罨问酱嬖?，可促進腫瘤細胞的生長及增殖，因而AKT已成為抗腫瘤藥物研發(fā)的重要靶點，例如一些廣譜的AKT抑制劑AZD5363、Afuresertib和MK2206等已經(jīng)作為抗乳腺癌、胃癌、骨髓瘤和前列腺癌的藥物進入到臨床試驗階段[8-9]。然而，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)AKT家族的成員AKT1在乳腺癌及前列腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移過程中有著不同的作用[10-11]，如AKT1的激活可以促進乳腺癌和前列腺癌細胞的增殖，但抑制了腫瘤細胞的遷移和侵襲；相反，當AKT1功能受到抑制后，乳腺癌和前列腺癌的生長雖然會受到明顯抑制，而轉(zhuǎn)移能力則明顯增強。這將帶來臨床合理用藥問題，即廣譜的AKT 抑制劑在抑制乳腺癌細胞增殖的同時很可能會導致癌細胞的轉(zhuǎn)移。

Figure 1. The protein expression of AKT1 in the MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells after transfected withAKT1 siRNA. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group.

Figure 2. The total protein expression of β-catenin in the MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells after transfected withAKT1 siRNA. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

Figure 3. The expression of nuclear β-catenin protein in the MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells after transfected withAKT1 siRNA. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group.

Figure 4. Immunohistochemical staining of β-catenin (green) in the MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells after transfected withAKT1 siRNA (×120). The cell nuclei were stained with Hoechst 33342 (blue).

Figure 5. The effects of XAV-939 (XAV) on the enhanced migration ability of MCF-7 cells (A and B) and MDA-MB-231 cells (A and C) induced by AKT1 inhibition (×20). Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vs1#siAKT1 group;△△P<0.01vs2#siAKT1 group.

最近，Li等[12]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中使用MK-2206抑制AKT1，可通過降解磷酸化依賴的Twist1誘導上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。然而，AKT1功能抑制導致的乳腺癌轉(zhuǎn)移能力增強的機制仍然不清楚。本研究證明β-catenin蛋白的核聚集介導了抑制AKT1誘導的乳腺癌轉(zhuǎn)移。β-catenin蛋白是細胞間黏附結(jié)構(gòu)的主要組成部分，可通過核移位進入細胞核促進腫瘤的轉(zhuǎn)移[13-14]。有文獻顯示廣譜的PI3K抑制劑GDC-0941可通過刺激Wnt的轉(zhuǎn)錄，促進乳腺癌細胞中β-catenin的核移位[15]。AKT1作為PI3K下游的信號分子，AKT1抑制劑很可能也是通過刺激Wnt的轉(zhuǎn)錄導致β-catenin核移位的。然而這種推論是否正確，尚需要進一步的實驗進行驗證。當然在肝癌、胃癌以及甲狀腺癌中，我們認為這種推論是不存在的，因為在這些腫瘤細胞中抑制AKT功能會導致β-catenin蛋白的水解，究其原因很可能是因為AKT1在不同的腫瘤中的作用是不同的。