傅興寧， 劉麗冰， 張志杰， 師 婷， 祝世功

(1濰坊市益都中心醫(yī)院， 山東 青州 262500；2山西醫(yī)科學大學汾陽學院，山西 汾陽 032200；3北京大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學院, 北京 100191)

可卡因及苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄物(cocaine- and amphetamine-regulated transcript，CART)肽是一種神經(jīng)內(nèi)分泌活性肽，因其mRNA表達可受可卡因和苯丙胺調(diào)節(jié)而得名[1]。CART肽在人體內(nèi)參與多種生理過程[2-3]，例如攝食、能量平衡、內(nèi)分泌和睡眠、肥胖、糖尿病、焦慮，應激及藥物依賴等。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)CART肽具有神經(jīng)保護作用，我們的前期工作證實CART肽可抑制缺血再灌注誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，從而減輕神經(jīng)元損傷[4]；CART肽可以通過上調(diào)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)促進海馬神經(jīng)元的存活[5]；CART肽抑制N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)誘導的海馬神經(jīng)元凋亡[6]。Jia等[7]報道，CART肽可通過激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)通路而減輕腦缺血再灌注引起的神經(jīng)元損傷；Sha等[8]報道，CART肽可增加線粒體呼吸鏈復合物II活性，從而抑制糖氧剝奪誘導的神經(jīng)元損傷。

腦缺血再灌注損傷常見于缺血性血管疾病，具有嚴重后果和社會危害。腦水腫是腦缺血后引起死亡的最主要并發(fā)癥，大量嚴重中風的病人死于腦水腫。腦水腫及其引起的高顱內(nèi)壓擠壓腦的重要區(qū)域，并導致腦神經(jīng)細胞的二次損傷[9]。目前已知，水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP-4)和血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)完整性與腦水腫的形成密切相關[10]。AQP-4在腦內(nèi)高表達，主要分布于腦微血管周圍星形膠質(zhì)細胞的終足和室管膜細胞上，具有保持腦內(nèi)水平衡的作用[11]。有研究報道，腦缺血再灌注損傷模型中，AQP-4的表達增多并加重腦水腫[12]。然而，CART肽是否對AQP-4具有作用，尚未見研究報道。我們推斷CART肽減輕腦缺血再灌注損傷而發(fā)揮神經(jīng)保護的作用機制可能與AQP-4及血腦屏障通透性有關。本實驗采用小鼠大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型進行了研究。

材 料 和 方 法

1 實驗動物和分組

清潔級雄性ICR小鼠(25～28 g)，購于北京大學醫(yī)學部實驗動物中心，許可證號為SYXK(京)2016-0041。室溫下每天光照 12 h, 黑暗 12 h，自由飲食水。將動物隨機分為假手術(sham)組、缺血(MCAO)組和CART肽(CART)組。CART組在腦缺血2 h后經(jīng)尾靜脈給予CART肽(2.5 μg/kg)處理,其它2組尾靜脈給予等量生理鹽水。

2 實驗方法

2.1MCAO動物模型的制作[13]動物術前禁食禁水12 h，手術時室溫控制在大約25 ℃左右。 將小鼠以10%水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射進行麻醉。仰臥位固定于操作臺上，備皮后做頸部正中切口，暴露出左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈。將頸總動脈夾閉，并將頸外動脈和頸內(nèi)動脈結扎。將頸外動脈由近心端剪斷，將預先用硅橡膠漆及肝素處理過的頭端約0.15 mm的魚線由頸外動脈缺口處插入，松開頸內(nèi)動脈，將魚線經(jīng)過頸內(nèi)動脈插入顱內(nèi)，直到插入頸內(nèi)動脈約(10±1)mm，感覺有輕微阻力時停止。將魚線從頸內(nèi)動脈上扎緊固定，消毒后縫合皮膚。2 h后將栓線拔出，恢復其再灌注。麻醉清醒后觀察其行為學，若出現(xiàn)對側(cè)前肢運動障礙及同側(cè)Horner氏綜合征則判為模型建立成功。假手術組條件同上，線栓進入長度約5 mm。

2.2腦梗死及腦水腫體積測定 腦梗死體積測量參照賈增強等[14]的方法,腦水腫體積測量方法參照Panahpour等[15]的方法。再灌注22 h后，將各組動物處死，取腦并將腦組織置于-20 ℃冰凍5 min，然后用刀片將腦組織由前向后冠狀切成2 mm的組織片。將組織片浸泡于0.5% 2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride，TTC)磷酸緩沖液中，37 ℃避光孵育15～20 min，然后用4%多聚甲醛溶液固定。梗死及水腫體積的百分比計算公式如下：梗死百分比(%)=(右側(cè)半球體積-左側(cè)半球未梗死體積)/右側(cè)半球體積×100%,腦水腫百分比(%)=(左側(cè)半球體積-右側(cè)半球體積)/右側(cè)半球體積×100%。

2.3腦組織中水含量的測定 參照Panahpour等[15]的方法，再灌注22 h后，將各組動物處死，取腦并將左右半球分離。分別稱量左右半球的濕重，然后將腦組織置于80 ℃干燥烤箱中烘烤24 h。將腦組織取出后立即稱量各半球的干重，然后按照以下公式進行計算：腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。得到各半球腦組織水含量后，再分別將同一只動物的左側(cè)半球腦組織水含量除以右側(cè)半球腦組織水含量，得到半球腦組織水含量之比。

2.4腦組織伊文思藍(Evans blue)漏出率測定 方法同前人所述[16]，動物再灌注18 h后，通過尾靜脈向小鼠體內(nèi)注射100 μL 2%伊文思藍溶液，并循環(huán)4 h。將小鼠麻醉后，開胸暴露心臟，經(jīng)左心室至升主動脈插管，用足量的生理鹽水快速灌流，直至剪開的右心耳處流出清澈液體為止。取腦并將左右半球分離，稱量各半球濕重，然后將各半球腦組織置于500 μL 二甲基甲酰胺中，勻漿，避光處理，60 ℃水浴24 h，12 000 r/min離心15 min，取上清液在635 nm測定吸光度(A)值，根據(jù)標準曲線求得上清液中伊文思藍的濃度，進而得到各半球中伊文思藍的總含量。將各半球中伊文思藍的總含量除以半球濕重得到左右兩側(cè)腦半球組織中伊文思藍濃度。

2.5免疫熒光觀察AQP-4表達變化 再灌注22 h后，將各組動物處死，4%多聚甲醛灌流固定后取腦，常規(guī)制作10 μm冰凍切片，5% BSA室溫封閉30 min，加兔抗AQP-4抗體(1 ∶400，Santa Cruz)，4 ℃過夜，次日在暗室中加入山羊抗兔的熒光Ⅱ抗，室溫孵育2 h后蓋上蓋玻片在熒光顯微鏡下觀察腦皮質(zhì)半影區(qū)。

2.6Western blot檢測AQP-4的表達水平 各組小鼠取腦后分離出缺血側(cè)半球腦皮質(zhì)，加入RIPA裂解液(碧云天)，電動勻漿器勻漿，12 000 r/min，4 ℃離心30 min;取上清，BCA法(Thermo Fisher Scientific)定量蛋白濃度;10% SDS-PAGE分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)膜;5%脫脂牛奶封閉1 h，加入兔抗AQP-4抗體(Santa Cruz)和β-action抗體(CST)，4 ℃過夜;加入HRP標記的Ⅱ抗(中杉金橋)，ECL試劑盒顯色檢測蛋白條帶。采用Quantity One軟件進行圖像灰度值分析，以β-action灰度值作為內(nèi)參照。

3 統(tǒng)計學處理

以GraphPad Prism 5.0軟件分析作圖。所有實驗結果以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 CART肽減少腦缺血再灌注后的腦水腫和梗死體積

經(jīng)過缺血2 h及再灌注22 h，腦梗死體積TTC染色結果見圖1A。與缺血組比較，CART肽明顯減輕了腦梗死體積百分比(P<0.01)，見圖1B。同時，CART肽明顯降低了腦水腫體積百分比(P<0.01)，見圖1C。

Figure 1. The effect of CART peptide on the infarct volume and swelling volume in the mice after cerebral ischemia/reperfusion. A: TTC staining; B: infarct volume; C: swelling volume. Mean±SD.n=4.** P<0.01vsMCAO group.

2 CART肽可明顯減輕腦缺血再灌注后腦水含量

與假手術組相比，缺血組中左側(cè)半球腦水含量明顯增加(P<0.01)；CART肽處理后，左側(cè)半球腦水含量明顯降低(P<0.01)。假手術組、缺血組和CART組中，右側(cè)半球的腦水含量差異不大，見圖2。

3 CART肽可降低腦缺血再灌注后血腦屏障的破壞程度

為檢驗腦缺血后血腦屏障的完整程度，我們檢測了伊文思藍的漏出率。與假手術組相比，缺血組左側(cè)腦半球伊文思藍的組織含量明顯升高(P<0.01)；CART肽處理則明顯減輕了這種升高(P<0.05)。假手術組、缺血組和CART組中，右側(cè)腦半球伊文思藍含量差異并不大，見圖3。

4 CART肽抑制腦缺血再灌注后小鼠腦組織AQP-4表達的上調(diào)

免疫熒光觀察半影區(qū)發(fā)現(xiàn)AQP-4陽性表達主要分布于腦微血管周圍。肉眼觀測MCAO組大腦皮層AQP-4陽性表達的微血管亮度高于sham組，而CART處理組相同腦區(qū)中AQP-4陽性表達的微血管亮度不及MCAO組，見圖4。

Figure 2. The effects of CART peptide on the water content in the brain tissue of the mice after cerebral ischemia/reperfusion. Mean±SD.n=4.##P<0.01vssham group;** P<0.01vsMCAO group.

Figure 3. The effects of CART peptide on the Evens blue leakage after cerebral ischemia/reperfusion in mice. Mean±SD.n=4.##P<0.01vssham group;*P<0.05vsMCAO group.

Figure 4. The effect of CART on the expression of AQP-4 in mice cortex after cerebral ischemia/reperfusion detected by immunohistochemistry staining (×200).

Western blot檢測半影區(qū)AQP-4表達，sham組的腦組織有一定量慢性表達， MCAO組腦組織中的AQP-4表達水平明顯升高(P<0.05)，而給予CART肽處理后，腦組織中AQP-4表達較MCAO組明顯減少(P<0.05)，見圖5。

討 論

缺血性腦血管疾病目前是臨床上一類常見的疾病，具有高致死、高致殘及并發(fā)癥難以治愈等特點[17]。腦缺血引起腦功能障礙的主要原因是腦水腫和腦細胞壞死，腦水腫作為腦缺血后最嚴重的并發(fā)癥，是目前導致缺血性腦卒中患者死亡的最主要原因。由于腦細胞壞死是不可逆的，因而防治腦水腫是臨床上治療的重點。腦梗塞后腦水腫有細胞毒性腦水腫和血管源性腦水腫2類。細胞毒性腦水腫，主要見于多種原因引起的急性缺氧如心跳驟停、窒息和腦循環(huán)中斷，此類腦水腫的微血管通透性不增高；血管源性腦水腫為最常見的一種，見于腦外傷、腦梗塞和血栓形成等，主要特點是腦微血管通透性增高，血腦屏障完整性被破壞。

Figure 5. The effect of CART peptide on the expression of AQP-4 in mouse cortex after cerebral ischemia/reperfusion detected by Western blot. Mean±SD.n=4.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsMCAO group.

CART肽是近些年新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性活性肽。雖然其受體至今尚未鑒定成功，但其廣泛的生物學作用，以及與臨床疾病的關系研究已積累的不少資料，近年來其神經(jīng)保護作用和臨床意義受到關注。我們的前期工作證實CART肽具有神經(jīng)營養(yǎng)作用，并可以通過上調(diào)BDNF保護海馬神經(jīng)元的存活，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激減輕腦缺血再灌注引起的神經(jīng)元凋亡[4-6]；Jia等[7]報道，CART肽可通過激活ERK通路而減輕腦缺血再灌注引起的神經(jīng)元損傷。這些神經(jīng)保護保護作用研究主要集中于對腦缺血后損傷的神經(jīng)元本身的保護，而對腦缺血引起的腦功能相關的血腦屏障，顱內(nèi)壓及腦水腫的作用缺乏研究。本實驗結果證明了我們的推斷，給予腦缺血再灌注損傷小鼠CART肽，能夠明顯減小腦的梗死體積及水腫體積，減少缺血側(cè)腦內(nèi)腦水含量。這說明CART肽在缺血再灌注的急性期不僅可以減小梗死體積，緩解癥狀，還可以減輕顱腦體積的增大，降低顱內(nèi)壓，減輕發(fā)生顱腦擠壓對神經(jīng)元的損傷。

缺血后腦水腫的形成機制目前還不是很清楚，現(xiàn)代醫(yī)學認為其發(fā)生發(fā)展過程涉及多種學說，如自由基學說，興奮性氨基酸學說、腦微循環(huán)和血腦屏障學說等。AQP-4作為水通道家族成員，其在腦內(nèi)含量最多，主要分布于腦微血管周圍星形膠質(zhì)細胞的終足和室管膜細胞上，被公認與腦水腫的形成具有重要關系[18]，有研究報道，在腦缺血再灌注損傷模型中，AQP- 4的表達增多并加重腦水腫[19]。在本實驗中，我們通過免疫熒光觀察及Western blot定量檢測發(fā)現(xiàn)，AQP-4主要是伴隨血管表達，給予CART肽處理后明顯抑制了腦缺血引起AQP-4高表達，同時CART也抑制腦缺血引起的血腦屏障通透性增高。這說明CART肽可能通過對AQP-4的抑制作用，減輕腦缺血引起的血腦屏障的破壞和通透性增加，進而減輕腦水腫程度。這提示AQP-4可能是CART肽減輕腦缺血再灌注損傷的重要作用靶分子。而CART肽抑制AQP-4表達的詳細分子機制，尚有待今后進一步深入探討。