周沫霖，胡卓炎*，余小林，趙 雷，羅 進(jìn)

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是一種分布于熱帶及亞熱帶的無患子科水果，其原產(chǎn)于中國(guó)南部及越南北部[1]。荔枝鮮果的貨架期非常短，常溫下不超過1 周。針對(duì)這一問題，研究者做了大量研究工作并發(fā)現(xiàn)荔枝鮮果對(duì)于高CO2體積分?jǐn)?shù)（3%～5%）和低O2體積分?jǐn)?shù)（4%～6%）的氣調(diào)貯藏有著良好的耐受性，且該氣調(diào)條件目前已應(yīng)用于荔枝產(chǎn)業(yè)中，以保持果肉硬度、減少果實(shí)腐爛[2]。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種廣泛存在于原核和真核生物中的四碳非蛋白氨基酸，但是其含量往往非常低。在植物中，GABA作為代謝產(chǎn)物參與了三羧酸循環(huán)的兩個(gè)分路[3]。它首先在谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）的催化下，通過L-谷氨酸或其鹽的不可逆的α-脫羧反應(yīng)合成。之后，GABA在線粒體內(nèi)的γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶（γ-aminobutyric acid transaminase，GABA-T）催化下，通過不可逆的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為琥珀酸半醛[4-5]。在哺乳動(dòng)物中，GABA可以通過超極化和分路抑制來降低神經(jīng)的活動(dòng)性，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最主要且含量最豐富的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[6]。此外，GABA還能夠抗焦慮、抗抑郁、抗過敏、抗癌、降血壓、促進(jìn)尿鈉排泄以及調(diào)節(jié)激素分泌[7-12]。

GABA富集是植物系統(tǒng)應(yīng)對(duì)非生物逆境（酸中毒、機(jī)械損傷、鹽脅迫、熱激冷激、低氧、干旱）的一種應(yīng)激反應(yīng)[13]。有研究證明，某些水果在應(yīng)對(duì)高體積分?jǐn)?shù)CO2環(huán)境時(shí)，其GABA會(huì)迅速富集，比如蘋果、西紅柿、草莓[14-16]，而植物在非生物逆境中的GABA富集可能是通過提高GAD活力、降低GABA-T活力實(shí)現(xiàn)的[17]。同時(shí)，高體積分?jǐn)?shù)CO2可能引起植物CO2損傷，而CO2損傷是一種在氣調(diào)貯藏期間能夠引起果蔬嚴(yán)重?fù)p傷的生理紊亂，這種損傷往往表現(xiàn)為果皮褐變和果肉軟化[18-19]。眾所周知，采后預(yù)冷對(duì)于荔枝冷鏈至關(guān)重要，其能夠提供有效的溫度管控，并且為隨后的貯藏或銷售移除田間熱。對(duì)于荔枝等亞熱帶水果來說，采后預(yù)冷帶來的瞬時(shí)低溫相當(dāng)于一種冷激脅迫，而有研究發(fā)現(xiàn)大豆、大麥、小麥在應(yīng)對(duì)冷激脅迫時(shí)，GABA含量將會(huì)顯著提高[20-21]。

關(guān)于荔枝在高體積分?jǐn)?shù)CO2氣調(diào)貯藏條件下的GABA富集研究，以及可能增加CO2誘發(fā)型生理?yè)p傷發(fā)生率的研究國(guó)內(nèi)外鮮見報(bào)道。因此，本研究的主要目的是分析GABA富集與鮮果對(duì)高體積分?jǐn)?shù)CO2環(huán)境的耐受性之間的關(guān)系，希望能夠闡明在高體積分?jǐn)?shù)CO2、低溫的氣調(diào)貯藏環(huán)境下激發(fā)GABA富集的機(jī)理，為獲得富含GABA的荔枝產(chǎn)品提供理論支持，同時(shí)提供一種高效的高體積分?jǐn)?shù)CO2氣調(diào)貯藏方法。本實(shí)驗(yàn)以荔枝GABA代謝的相關(guān)產(chǎn)物及相關(guān)酶活力為指標(biāo)，分析荔枝GABA富集與荔枝對(duì)高體積分?jǐn)?shù)CO2氣調(diào)貯藏的耐受性之間的關(guān)系；研究CO2氣調(diào)環(huán)境對(duì)鮮果可溶性蛋白、硬度、色差、感官評(píng)定的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荔枝鮮果：品種為‘懷枝’，2016年7月14日采摘于廣州從化的商業(yè)果園。荔枝于成熟期被采摘，隨后在2 h內(nèi)轉(zhuǎn)移到位于廣州的實(shí)驗(yàn)室。到達(dá)后，荔枝立即按照色澤和大小被分類以保證樣品一致，并剔除有任何損傷的荔枝。隨后，將荔枝分別置于約4 ℃冰水混合物或4 ℃冷庫(kù)中預(yù)冷2 h，使果溫均降至4 ℃左右，立即測(cè)定預(yù)冷影響的相關(guān)指標(biāo)。

GABA、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（tris(hydroxymethyl)aminomethane-hydrochloride，Tris-HCl）、α-酮戊二酸、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、磷酸吡哆醛（pyridoxal 5’-phosphatemonohydrate，PLP）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、丙酮酸、L-丙氨酸脫氫酶 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；乙腈、甲醇美國(guó)Honeywell公司；Miracloth濾膜 德國(guó)Calbiochem公司；CO2、O2、N2混合氣體 佛山華特氣體有限公司；氯化鑭、焦磷酸鉀、L-谷氨酸、丙氨酸、鄰苯二甲醛、磺基水楊酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、乙酸鈉、乙酸、鹽酸、β-巰基乙醇、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清白蛋白等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-10AT高效液相色譜儀、UV-2550PC紫外-可見分光光度計(jì)、AUW120D分析天平 日本Shimadzu公司；ZORBAX SB C18液相色譜柱 美國(guó)Agilent公司；Heto PowerDry PL3000冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；5430R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；Checkmate-9900氣體分析儀 丹麥PBI-Dansensor公司；CM-3500d色差儀 日本Minolta公司；TA500質(zhì)構(gòu)儀英國(guó)Lloyd Instruments公司；FE20 pH計(jì) 瑞士Mettler-Toledo公司；HWS24恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

表 1 CO2氣調(diào)貯藏的實(shí)驗(yàn)分組Table 1 Experimental grouping of CO2 controlled atmosphere storage

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

24 kg經(jīng)冰水預(yù)冷處理的‘懷枝’和24 kg經(jīng)冷庫(kù)預(yù)冷處理的‘懷枝’各自隨機(jī)分成4組，每組6 kg，隨后每組又被等分成3 個(gè)平行組，每個(gè)平行組2 kg。為了研究CO2氣調(diào)貯藏的影響，上述荔枝分別被置于24 個(gè)獨(dú)立的氣調(diào)貯藏箱中，每個(gè)氣調(diào)貯藏箱的體積大約為8 L，CO2氣調(diào)貯藏實(shí)驗(yàn)的分組情況如表1所示。所有氣調(diào)貯藏箱均與持續(xù)通氣的氣體控制系統(tǒng)相連接，以100 mL/min的氣體流速分別流通不同組分的氣體，并且使用氣體分析儀每日監(jiān)測(cè)氣體成分。所有氣調(diào)貯藏箱均置于4 ℃的冷庫(kù)中貯藏20 d，且通過橡膠導(dǎo)管與置于冷庫(kù)外的氣體控制系統(tǒng)相連接。為了避免荔枝本身自發(fā)氣調(diào)對(duì)氣調(diào)貯藏箱內(nèi)氣體成分的影響，在整個(gè)貯藏期間，所有的氣調(diào)貯藏箱均持續(xù)流通濕潤(rùn)空氣或混合氣。每2 d取樣一次，每次分別從24 個(gè)氣調(diào)貯藏箱中隨機(jī)取5 顆荔枝。荔枝鮮果取出后，室溫放置約1 h，測(cè)定果皮色差，隨后去皮核，果肉沿果蒂方向縱切成兩半。一半果肉液氮研磨，用于GABA以及相關(guān)代謝酶的分析。另一半果肉用于質(zhì)構(gòu)分析、果肉色差分析、感官評(píng)定。

1.3.2 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.2.1 GABA含量的測(cè)定

GABA含量根據(jù)黃敏欣等[22]的方法測(cè)定，并做了部分修改。取100 mg鄰苯二甲醛溶于5 mL甲醇，加入20 mL 0.4 mol/L硼酸緩沖液（pH 10.2）和300 μL β-巰基乙醇，得鄰苯二甲醛衍生劑。取0.2 g荔枝果肉勻漿置于1 mL鄰苯二甲醛衍生劑，振蕩30 s，4 ℃、10 000×g離心5 min，取上清液，0.45 μm水系濾頭過濾，待用。GABA含量的測(cè)定采用高效液相色譜儀，色譜柱為ZORBAX SB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為25 mmol/L乙酸鈉（乙酸調(diào)pH值至5.90±0.05），流動(dòng)相B為乙腈；流速為1.0 mL/min，梯度洗脫程序?yàn)椋? min，90%流動(dòng)相A，10%流動(dòng)相B；30 min，40%流動(dòng)相A，60%流動(dòng)相B；35 min，40%流動(dòng)相A，60%流動(dòng)相B；40 min，90%流動(dòng)相A，10%流動(dòng)相B；45 min，90%流動(dòng)相A，10%流動(dòng)相B。柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL；紫外檢測(cè)器檢測(cè)的波長(zhǎng)為332 nm。

1.3.2.2 GAD、GABA-T活力的測(cè)定

酶提取參考Zhou Molin等[23]的方法，并作部分修改。稱取2 g樣品置于10 mL經(jīng)過預(yù)冷的0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液中（pH 9.1，含體積分?jǐn)?shù)10%丙三醇、1 mmol/L DTT、2 mmol/L EDTA、1 mmol/L PLP、0.5 mmol/L PMSF），振蕩10 min，Miracloth濾膜過濾，4 ℃、20 000×g離心20 min，取上清液用于GAD和GABA-T活力的測(cè)定。

GAD活力的測(cè)定參考Bartyzel等[24]的方法，并作部分修改。GAD活力以每秒每千克GAD催化生成GABA的物質(zhì)的量表征，單位為mmol/（kg·s）。0.4 mL反應(yīng)體系（包括0.25 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH 5.8）、0.04 mmol/L PLP、0.02 mL樣品上清液）于30 ℃水浴預(yù)孵化10 min，隨后添加0.04 mL 30 mmol/L L-谷氨酸啟動(dòng)反應(yīng)，30 ℃水浴保溫60 min后，添加0.1 mL 0.5 mol/L鹽酸終止反應(yīng)。反應(yīng)終止后4 ℃、12 500×g離心10 min，取上清液以1.3.2.1節(jié)的方法測(cè)定GABA含量，并計(jì)算GAD活力。

GABA-T活力的測(cè)定參考Ansari等[25]的方法，并作部分修改。GABA-T活力以每秒每千克過丙氨酸脫氫酶（alanine dehydrogenase，ADH）催化生成丙氨酸（Ala）的物質(zhì)的量表征，以Ala標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（0～5×10-3mol/L），通過ADH的酶促反應(yīng)確定Ala產(chǎn)量，單位為mmol/（kg·s）。GABA-T活力的測(cè)定由兩部分組成：首先，0.5 mL反應(yīng)體系一（包括50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.2）、1.5 mmol/L DTT、0.75 mmol/L EDTA、0.1 mmol/L PLP、體積分?jǐn)?shù)10%丙三醇、15 mmol/L GABA、0.02 mL樣品上清液）于30 ℃水浴預(yù)孵化10 min后，添加0.05 mL 40 mmol/L丙酮酸啟動(dòng)反應(yīng)，30 ℃水浴60 min后，添加0.05 mL 40 mmol/L磺基水楊酸終止反應(yīng)，得到已終止反應(yīng)液。隨后，0.5 mL反應(yīng)體系二（包括70 mmol/L碳酸鈉緩沖液（pH 10）、1.5 mmol/L NAD、0.1 unit ADH）于25 ℃水浴條件下預(yù)孵化20 min，添加0.02 mL已終止反應(yīng)液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，并25 ℃水浴20 min。在340 nm波長(zhǎng)處測(cè)定反應(yīng)啟動(dòng)時(shí)至水浴20 min時(shí)吸光度的增加量，并以Ala標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Ala產(chǎn)量，進(jìn)而計(jì)算GABA-T活力。

1.3.2.3 可溶性蛋白含量測(cè)定

可溶性蛋白含量根據(jù)Bradford[26]的方法測(cè)定，以牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（0～1 mg/mL）。

1.3.2.4 質(zhì)構(gòu)分析

荔枝鮮果置于室溫中，平衡1 h。取已稱質(zhì)量的果肉切片（大約20 mm×20 mm×5.0 mm），置于Kramer剪切槽，探頭下降速率為100 mm/min，檢測(cè)果肉硬度。

1.3.2.5 色差分析

采用色差儀測(cè)定，每個(gè)荔枝測(cè)3 次色差（底部及赤道面兩側(cè)各1 次）。色差值表示為CIE L*（明度/暗度）、a*（紅色/綠色）、b*（黃色/藍(lán)色）。

1.3.2.6 感官評(píng)價(jià)

荔枝感官評(píng)價(jià)使用模糊綜合評(píng)價(jià)法，由10 名經(jīng)過培訓(xùn)的具有食品專業(yè)背景的碩士研究生組成感官評(píng)價(jià)小組，確定果皮色澤、果肉色澤、肉質(zhì)、風(fēng)味、汁液、香氣為評(píng)價(jià)因素。

U＝{u1（果皮色澤），u2（果肉色澤），u3（肉質(zhì)），u4（風(fēng)味），u5（汁液），u6（香氣）}

5 個(gè)水平被確定為評(píng)價(jià)水平：

V＝{v1（優(yōu)），v2（良），v3（中等），v4（較差），v5（差）}

建立模糊矩陣，關(guān)聯(lián)評(píng)價(jià)因素和評(píng)價(jià)水平：

果皮色澤、果肉色澤、肉質(zhì)、風(fēng)味、汁液、香氣的權(quán)重被確定為：

A＝{a1（果皮色澤），a2（果肉色澤），a3（肉質(zhì)），a4（風(fēng)味），a5（汁液），a6（香氣）}

＝{0.1，0.2，0.2，0.2，0.2，0.1}

模糊綜合評(píng)價(jià)的結(jié)果集為：

歸一化組合索引值：

B’ =（b1’，b2’，b3’，b4’，b5’）

根據(jù)感官評(píng)價(jià)的特殊性，設(shè)置優(yōu)：95 分，良：87.5 分，中等：82.5 分，較差：75 分，差：65 分；建立模糊綜合評(píng)分矩陣[27]：

模糊綜合評(píng)價(jià)總分：

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為完全隨機(jī)設(shè)計(jì)。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間均值比較使用單因素方差分析（One-way ANOVA），數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。差異性檢驗(yàn)使用鄧肯氏新復(fù)極差法，P＜0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 采后預(yù)冷對(duì)荔枝GABA富集的影響

表 2 預(yù)冷方式對(duì)荔枝果肉GABA含量、GAD活力、GABA-T活力、可溶性蛋白含量、硬度的影響Table 2 Effects of different precooling methods on GABA content,GAD, GABA-T activities and total soluble protein content, pulp firmness of litchi

冷激脅迫是一種能引起某些植物GABA富集的非生物脅迫[28]。如表2所示，采后預(yù)冷作為冷激脅迫的一種方式，與對(duì)照（無預(yù)冷處理）相比，冰水預(yù)冷、冷庫(kù)預(yù)冷均能顯著提高荔枝的GABA含量、GAD活力、GABA-T活力，且冰水預(yù)冷處理組的增加量大于冷庫(kù)預(yù)冷。該發(fā)現(xiàn)與前人對(duì)大豆、大麥、小麥的研究結(jié)果一致[20-21]，而不同預(yù)冷處理組的GABA富集量差異可能是由于冷激脅迫強(qiáng)度的不同。與對(duì)照組相比，冰水預(yù)冷處理組和冷庫(kù)預(yù)冷處理組的可溶性蛋白含量均顯著下降，但兩處理組之間沒有顯著性差異，這可能是由于采后預(yù)冷作為一種非生物脅迫，植物在應(yīng)激脅迫的過程中，需要消耗一定量的可溶性蛋白以維持自身的正常生理活動(dòng)。冰水預(yù)冷處理后的果肉硬度顯著增加，而冷庫(kù)預(yù)冷處理后的并沒有顯著變化。從荔枝果肉GABA富集和食用品質(zhì)看，冰水預(yù)冷處理均有更好的效果。

2.2 氣調(diào)貯藏對(duì)荔枝GABA含量的影響

GABA是荔枝生長(zhǎng)過程中一種重要的氨基酸，參與了氧化應(yīng)激防護(hù)、調(diào)節(jié)滲透平衡、維持細(xì)胞質(zhì)溶質(zhì)pH值、動(dòng)態(tài)氮貯藏等植物生理生化功能[29]。如圖1所示，從CO2氣調(diào)貯藏的體積分?jǐn)?shù)來看，在整個(gè)氣調(diào)貯藏過程中，不論是經(jīng)冰水預(yù)冷處理還是冷庫(kù)預(yù)冷處理后，CO2氣調(diào)貯藏后荔枝的GABA含量總體上呈先上升后下降的趨勢(shì)。其中，經(jīng)冰水預(yù)冷處理的荔枝的GABA含量在體積分?jǐn)?shù)10% CO2氣調(diào)貯藏的第4天達(dá)到峰值（19.97 mmol/kg mf），較第0天增加了0.4 倍；而冷庫(kù)預(yù)冷處理的GABA含量在體積分?jǐn)?shù)10% CO2氣調(diào)貯藏的第6天達(dá)到峰值（17.13 mmol/kg mf），較第0天增加了0.5 倍。更高體積分?jǐn)?shù)的CO2氣調(diào)處理有著更高的GABA富集量，這個(gè)模式歸因于高體積分?jǐn)?shù)CO2氣調(diào)處理將降低細(xì)胞質(zhì)溶質(zhì)的pH值，進(jìn)而刺激GAD活力提高，從而導(dǎo)致GABA富集。此外，兩種預(yù)冷處理的空氣對(duì)照組的GABA含量均呈平穩(wěn)下降的趨勢(shì)。然而，本實(shí)驗(yàn)對(duì)于荔枝GABA富集的發(fā)現(xiàn)與其他園藝產(chǎn)品的研究并不一致。Deyman等[14]研究發(fā)現(xiàn)，不論是空氣對(duì)照處理還是2.5 kPa CO2氣調(diào)處理，蘋果GABA含量均穩(wěn)步增加；Blanch等[16]發(fā)現(xiàn)體積分?jǐn)?shù)40% CO2氣調(diào)處理的草莓有著最高水平的GABA富集量，而體積分?jǐn)?shù)20% CO2氣調(diào)處理的GABA富集量與空氣對(duì)照組并沒有顯著差別；Merodio等[30]使用體積分?jǐn)?shù)20%CO2+體積分?jǐn)?shù)20% O2處理番荔枝，觀察到GABA富集，而后將其轉(zhuǎn)移至環(huán)境條件，GABA則迅速代謝分解。這些發(fā)現(xiàn)表明，不同園藝產(chǎn)品在應(yīng)對(duì)CO2氣調(diào)貯藏時(shí)的GABA富集模式有著巨大的差異，這可能是由于GABA富集是植物體內(nèi)一種瞬時(shí)調(diào)節(jié)非生物脅迫的反應(yīng)，在短暫富集后，會(huì)持續(xù)降低；而短暫富集的時(shí)間可能是幾分鐘或者幾周，這取決于非生物脅迫的種類、強(qiáng)度以及物種對(duì)非生物脅迫的耐受性。從預(yù)冷方式來看，荔枝GABA富集的總體趨勢(shì)并不受預(yù)冷方式的影響，但是經(jīng)冰水預(yù)冷處理的GABA富集量高于冷庫(kù)預(yù)冷處理。

圖 1 氣調(diào)貯藏對(duì)荔枝GABA含量的影響Fig. 1 Effect of controlled atmosphere storage on GABA content of litchi

2.3 氣調(diào)貯藏對(duì)荔枝GAD、GABA-T活力的影響

圖 2 氣調(diào)貯藏對(duì)荔枝GAD活力的影響Fig. 2 Effect of controlled atmosphere storage on GAD activity of litchi

CO2氣調(diào)貯藏作為一種非生物脅迫，能夠?qū)е录?xì)胞質(zhì)酸化，而在應(yīng)對(duì)細(xì)胞質(zhì)酸化的過程中，植物GAD活力主要取決于細(xì)胞質(zhì)pH值和Ca2+/鈣調(diào)素（calmodulin，CaM）活性。如圖2所示，所有CO2氣調(diào)組的GAD活力與GABA含量變化趨勢(shì)相同，均呈先上升后下降趨勢(shì)，且更高體積分?jǐn)?shù)的CO2氣調(diào)組處理有著更高的GAD活力，而所有空氣空白組均呈平穩(wěn)下降趨勢(shì)。對(duì)于經(jīng)冰水預(yù)冷處理的荔枝，體積分?jǐn)?shù)10% CO2實(shí)驗(yàn)組的GAD活力在氣調(diào)貯藏的第4天達(dá)到峰值（24.81 mmol/（kg·s）），較第0天增加了0.8 倍；而經(jīng)冷庫(kù)預(yù)冷處理的荔枝，體積分?jǐn)?shù)10% CO2實(shí)驗(yàn)組的GAD活力在第6天達(dá)到峰值（20.67 mmol/（kg·s）），較第0天增加了1.0 倍。與GABA含量相同的變化趨勢(shì)可能是因?yàn)镚AD是植物中最主要的GABA合成酶，它通過催化L-谷氨酸或其鹽經(jīng)不可逆的α-脫羧反應(yīng)合成GABA。與GABA含量變化趨勢(shì)相同，荔枝GAD活力的總體變化趨勢(shì)同樣不受預(yù)冷方式的影響，但是經(jīng)冰水預(yù)冷處理的GAD活力高于冷庫(kù)預(yù)冷處理。GAD活力的動(dòng)態(tài)變化可以防止細(xì)胞溶質(zhì)pH值的過度增加，同時(shí)增強(qiáng)植物對(duì)胞質(zhì)酸化的抗性[31]。Gut[32]和Shelp[33]等研究發(fā)現(xiàn)，植物GAD在應(yīng)對(duì)不同細(xì)胞質(zhì)溶質(zhì)pH值下的不同細(xì)胞內(nèi)脅迫時(shí)，表現(xiàn)出兩種相對(duì)獨(dú)立的植物GAD調(diào)節(jié)機(jī)制：當(dāng)pH值環(huán)境為中性時(shí)，植物通過Ca2+釋放來誘導(dǎo)CaM的構(gòu)象發(fā)生變化，引導(dǎo)GAD和CaM結(jié)合結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，從而激活GAD；當(dāng)處于酸性pH值環(huán)境時(shí)，雖然GAD活力受主要受pH值調(diào)控，但是GAD依然可以通過從活性位點(diǎn)釋放出CaM結(jié)合結(jié)構(gòu)域來調(diào)節(jié)，即使此時(shí)這種由Ca2+/CaM來刺激提高GAD活力的作用是微不足道的。

圖 3 氣調(diào)貯藏對(duì)荔枝GABA-T活力的影響Fig. 3 Effect of controlled atmosphere storage on GABA-T activity of litchi

不同來源的GABA-T均屬于PLP依賴型酶家族，并對(duì)作為氨基供體的GABA具有特異性，且在pH 7.8～9.5時(shí)活力最高，并以同源二聚體的自然結(jié)構(gòu)存在[33-34]。如圖3所示，所有實(shí)驗(yàn)組的GABA-T活力均呈波動(dòng)狀態(tài)，且均無顯著的規(guī)律，表明荔枝GABA-T活力并沒有受到預(yù)冷方式和CO2氣調(diào)貯藏的影響，且在目前的研究中，GABA-T活力和GABA分解代謝之間并沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。結(jié)合GAD、GABA-T活力的變化趨勢(shì)，表明荔枝GABA在CO2氣調(diào)貯藏過程中的富集是由于GAD活力提高而催化生產(chǎn)出更多GABA，而不是依靠降低GABA-T活力來減少GABA的降解。該結(jié)論為闡明CO2氣調(diào)貯藏過程中的植物GABA富集調(diào)控機(jī)制提供了可能性：首先，高體積分?jǐn)?shù)CO2氣調(diào)環(huán)境導(dǎo)致植物組織的細(xì)胞質(zhì)酸化，這可能是由于植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)溶質(zhì)、液泡、質(zhì)外體腔室的pH值分別為7.2～7.6、5.8～5.9、5.6～6.0[35]，而細(xì)胞腔室的分解程度不同導(dǎo)致質(zhì)外體和液泡的質(zhì)子釋放到細(xì)胞質(zhì)中[36]，進(jìn)而使得細(xì)胞質(zhì)酸化。然后，細(xì)胞質(zhì)酸化通過激活GAD活力來富集GABA。此外，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，pH值不斷升高，當(dāng)胞質(zhì)pH值環(huán)境達(dá)到中性時(shí)，GAD變?yōu)镃a2+依賴型，并轉(zhuǎn)而由CaM結(jié)合結(jié)構(gòu)域來調(diào)控。

2.4 氣調(diào)貯藏對(duì)荔枝可溶性蛋白含量的影響

目前，可溶性蛋白對(duì)GABA富集的影響是有爭(zhēng)議性的。Shelp等[37]研究表明，GABA的富集則是通過在胞質(zhì)Ca2+/CaM依賴型GAD周圍提高谷氨酸的濃度來實(shí)現(xiàn)的，而這個(gè)過程是通過減少可溶性蛋白合成、增加可溶性蛋白降解、抑制谷氨酰胺合成來實(shí)現(xiàn)的。而Xu Jiangguo等[38]則認(rèn)為，在大豆（Glycine max L.）種子發(fā)芽過程中，GABA富集主要受GAD調(diào)節(jié)，而不需要通過蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生足夠的谷氨酸。如圖4所示，所有實(shí)驗(yàn)組的可溶性蛋白含量先上升后趨于相對(duì)穩(wěn)定，大約穩(wěn)定在80～180 mg/kg mf，究其原因，可能是荔枝持續(xù)的失水導(dǎo)致可溶性蛋白含量上升；隨后，植物代謝消耗了一部分可溶性蛋白，降低了其含量，同時(shí)，不溶性蛋白轉(zhuǎn)換為可溶性蛋白，增加了其含量，最終達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，使得可溶性蛋白含量趨于平穩(wěn)。其中，空氣對(duì)照組的可溶性蛋白含量最高，體積分?jǐn)?shù)10% CO2實(shí)驗(yàn)組含量最低，而不同預(yù)冷處理組間明顯差異，表明可溶性蛋白含量受CO2氣調(diào)環(huán)境影響，而不受預(yù)冷方式影響。這可能是由于可溶性蛋白是一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而非應(yīng)激產(chǎn)物，高強(qiáng)度的脅迫只會(huì)使植物消耗更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以維持自身的正常生理功能。

圖 4 氣調(diào)貯藏對(duì)荔枝可溶性蛋白含量的影響Fig. 4 Effect of controlled atmosphere storage on soluble protein content of litchi

2.5 氣調(diào)貯藏對(duì)荔枝果肉硬度的影響

圖 5 氣調(diào)貯藏對(duì)荔枝果肉硬度的影響Fig. 5 Effect of controlled atmosphere storage on pulp firmness of litchi

機(jī)械性斷裂時(shí)的剪切應(yīng)力是用于檢測(cè)果肉硬度的基本的質(zhì)構(gòu)分析方法。如圖5所示，所有實(shí)驗(yàn)組的果肉硬度均呈下降趨勢(shì)。從氣調(diào)貯藏的CO2體積分?jǐn)?shù)來看，體積分?jǐn)?shù)3% CO2氣調(diào)貯藏對(duì)于保持荔枝果肉硬度的效果最好，特別是在氣調(diào)貯藏的后期，這可能是由于該體積分?jǐn)?shù)的CO2氣調(diào)能夠更好地抑制荔枝果肉軟化。而高體積分?jǐn)?shù)CO2可能引起荔枝果肉的CO2損傷，進(jìn)而導(dǎo)致果肉硬度迅速下降，這可能是由于細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的分解和細(xì)胞壁降解酶活力的增強(qiáng)。從預(yù)冷方式來看，冰水預(yù)冷處理對(duì)保持荔枝果肉硬度的效果優(yōu)于冷庫(kù)預(yù)冷。

2.6 氣調(diào)貯藏對(duì)荔枝色差的影響

表 3 氣調(diào)貯藏對(duì)荔枝果皮色差的影響Table 3 Effect of controlled atmosphere storage on pericarp color of litchi

荔枝果皮果肉的顏色對(duì)于其商品價(jià)值有著重要意義。由表3可知，所有實(shí)驗(yàn)組的L*值、a*值、b*值均隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。從氣調(diào)貯藏的CO2體積分?jǐn)?shù)來看，體積分?jǐn)?shù)5% CO2實(shí)驗(yàn)組的下降趨勢(shì)慢于其他各氣調(diào)實(shí)驗(yàn)組，特別是在氣調(diào)貯藏的后期。這可能是由于較高的CO2氣調(diào)體積分?jǐn)?shù)能夠降低控制荔枝果皮褐變的關(guān)鍵酶——多酚氧化酶的活力，進(jìn)而延緩果皮褐變。同時(shí)，更高體積分?jǐn)?shù)的CO2氣調(diào)貯藏將會(huì)引起荔枝的CO2損傷，反而加速了荔枝腐敗。從預(yù)冷方式來看，冰水預(yù)冷處理的色差值下降趨勢(shì)慢于冷庫(kù)預(yù)冷；這可能是由于在采后預(yù)冷過程中，相較冷庫(kù)預(yù)冷，冰水預(yù)冷能夠通過與冰水混合物直接接觸，以熱傳導(dǎo)的形式降低果溫，這種方式能夠減少荔枝果皮水分的喪失、延緩果皮褐變。

表 4 氣調(diào)貯藏對(duì)荔枝果肉色差的影響Table 4 Effect of controlled atmosphere storage on pulp color of litchi

由表4可知，所有實(shí)驗(yàn)組的L*值、a*值、b*值隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)均呈下降趨勢(shì)，冰水預(yù)冷處理組的下降趨勢(shì)慢于冷庫(kù)預(yù)冷，但是各氣調(diào)實(shí)驗(yàn)組間并沒有顯著差異

（除了冰水預(yù)冷處理組在氣調(diào)貯藏第20天的L*值）。從氣調(diào)貯藏的CO2體積分?jǐn)?shù)來看，荔枝果肉色差的結(jié)果與果皮色差、果肉硬度變化結(jié)果均有所差異，雖然體積分?jǐn)?shù)5% CO2的氣調(diào)貯藏條件依然表現(xiàn)出最佳貯藏能力，但是各氣調(diào)組間L*、b*值均沒有表現(xiàn)出顯著差異，這可能是由于果肉色差變化不同于果皮褐變，其并沒有明顯的色澤變化，且各樣本之間有著較大的個(gè)體差異。此外，相比果皮色差較早出現(xiàn)褐斑等負(fù)面變化，果肉色差變化具有一定的滯后性。從預(yù)冷方式來看，冰水預(yù)冷能夠更快地降低果溫，從而迅速降低果肉的生理活性，有利于維持果肉色澤。

2.7 氣調(diào)貯藏對(duì)荔枝感官品質(zhì)的影響

表 5 氣調(diào)貯藏對(duì)荔枝感官品質(zhì)的影響Table 5 Effect of controlled atmosphere storage on sensory quality of litchi

荔枝作為一種水果，歸根結(jié)底其直接受用對(duì)象是人，而荔枝的某些性狀難以完全依靠?jī)x器檢測(cè)及化學(xué)分析，因此，感官評(píng)定在荔枝的綜合評(píng)價(jià)中有著重要意義。如表5所示，所有實(shí)驗(yàn)組的感官得分均隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，但是冰水預(yù)冷處理組的下降趨勢(shì)慢于冷庫(kù)預(yù)冷處理組，體積分?jǐn)?shù)5% CO2實(shí)驗(yàn)組的下降趨勢(shì)慢于其他各氣調(diào)實(shí)驗(yàn)組。對(duì)于冰水預(yù)冷處理的荔枝，體積分?jǐn)?shù)5% CO2實(shí)驗(yàn)組在第20天基本喪失了食用價(jià)值，而體積分?jǐn)?shù)10% CO2實(shí)驗(yàn)組由于CO2損傷，在第16天已完全失去了食用價(jià)值，并整果褐變，且在果皮和果肉之間出現(xiàn)了“鐵銹水”。這表明控制CO2損傷的發(fā)生率是CO2氣調(diào)貯藏中一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。同時(shí)，體積分?jǐn)?shù)5% CO2實(shí)驗(yàn)組具有最高的感官得分，而體積分?jǐn)?shù)3% CO2實(shí)驗(yàn)組與空氣組之間沒有明顯差異，這表明篩選一個(gè)準(zhǔn)確有效的CO2體積分?jǐn)?shù)，并能夠精準(zhǔn)控制，對(duì)于提高荔枝CO2氣調(diào)貯藏的效果至關(guān)重要。

3 結(jié) 論

在整個(gè)氣調(diào)貯藏過程中，各CO2氣調(diào)實(shí)驗(yàn)組的GABA含量和GAD活力均呈先上升后下降趨勢(shì)，且更高體積分?jǐn)?shù)的CO2氣調(diào)貯藏與更高的GABA富集量、更高的GAD活力具有一致性；然而，各CO2氣調(diào)實(shí)驗(yàn)組的GABA-T活力呈劇烈波動(dòng)狀態(tài)。該結(jié)果表明荔枝GABA富集是由于GAD活力的增強(qiáng)催化了GABA的生成，而不是由于GABA-T活力的下降抑制了GABA的分解。體積分?jǐn)?shù)3% CO2氣調(diào)貯藏能夠抑制荔枝果肉的軟化，而體積分?jǐn)?shù)5% CO2氣調(diào)貯藏能夠延緩荔枝感官品質(zhì)、荔枝果皮果肉色差值的下降，同時(shí)，過高的CO2體積分?jǐn)?shù)可能會(huì)引起荔枝的CO2損傷。此外，從荔枝GABA富集和貯藏品質(zhì)來看，冰水預(yù)冷的效果優(yōu)于冷庫(kù)預(yù)冷。