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(1. 山東農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院， 土肥資源高效利用國家工程實驗室， 山東 泰安271018；2. 山東省畜牧總站， 山東 濟南250022)

土地鹽堿化已經(jīng)對全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴重的影響，而不合理的開發(fā)利用和生態(tài)環(huán)境的不斷惡化使鹽堿地面積進一步擴大[1-2]。目前，全球鹽堿地面積約為10億hm2，約占全球陸地面積的6.7%，已成為僅次于干旱的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)第二大非生物脅迫因素[3]。中國鹽堿地總面積約為0.99億hm2，約占國土面積的1/3，主要分布在東北、華北、西北內(nèi)陸地區(qū)以及長江以北沿海地帶[1,4]。

苜蓿(MedicagoL.)有“牧草之王”的美譽，具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強、適口性好等特點，其在牧草生產(chǎn)中的作用和地位不斷提升[5]。世界各國廣泛引種苜蓿，育成了大量苜蓿種質(zhì)材料[6-7]。鹽害是限制苜蓿廣泛種植的重要因素之一[6,8]。苜蓿在中輕度鹽堿土壤中生長良好，若能進一步提高其耐鹽性，使其適應鹽堿度更高的土壤，將會大大擴展苜蓿的適宜種植范圍，有利于提高鹽堿地利用效率。國內(nèi)外學者對于苜蓿耐鹽堿性的生理生化機制[9-10]、耐鹽種質(zhì)篩選、優(yōu)良品種選育等方面做了大量工作[11-13]。但已有的研究在時期選擇上主要集中于苗期，而萌發(fā)期耐鹽篩選研究較少，有待在已有研究的基礎上，總結(jié)一種苜蓿萌發(fā)期耐鹽綜合評價體系。萌發(fā)是作物生長的第一個階段，種子能否萌發(fā)是其在鹽堿地推廣利用的一個重要前提因素。本研究采用加權(quán)隸屬函數(shù)法，采用多個鑒定指標并進行加權(quán)計算，對120個苜蓿種質(zhì)材料進行萌發(fā)期耐鹽性評價，以探明苜蓿萌發(fā)期的耐鹽性綜合性評價方法，同時篩選萌發(fā)期耐鹽性較強的優(yōu)良種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試苜蓿種質(zhì)材料為120個品種(含115個紫花苜蓿，5個雜花苜蓿)，其中107個由國家植物種質(zhì)資源共享平臺提供，7個商業(yè)種購自北京克勞沃種業(yè)，6個材料由新疆農(nóng)科院惠贈。來源和編號詳見表1。

表1 供試苜蓿種質(zhì)材料地理來源及編號Table 1 Geographical origin and code of tested varieties of alfalfa

1.2 耐鹽性鑒定

利用智能型光照培養(yǎng)箱進行種子萌發(fā)試驗，采用紙上發(fā)芽法。設蒸餾水(對照)和鹽脅迫(150 mmol·L-1NaCl溶液)2種處理，3次重復，每個重復50粒。試驗前先將種子用10%的過氧化氫(H2O2)滅菌5分鐘，用蒸餾水沖洗干凈后將種子均勻地擺放在發(fā)芽盒中，鹽脅迫和對照組分別加入鹽溶液和蒸餾水各15 mL。培養(yǎng)條件為白天16 h，25℃；晚上8 h，20℃。

發(fā)芽標準為胚根與種子等長，苗高為種子長的1/2。培養(yǎng)的第4天開始，隔天統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)，計算發(fā)芽勢(germination potential，GP)、發(fā)芽率(germination rate，GR)和萌發(fā)指數(shù)(germination index，GI)；培養(yǎng)的第10天每盒分別隨機挑取10株幼苗，分別測量根長(root length，RL)，即根尖到子葉著生點的長度；苗高(shoot height，SH)，即從子葉著生點到葉尖的長度。然后把根和苗分開，稱量根鮮重(root fresh weight，RFW)和苗鮮重(shoot fresh weight，SFW)后，分別放入紙袋里，105℃殺青1小時，75℃繼續(xù)烘干至衡重，稱量根干重(root dry weight，RDW)和苗干重(shoot dry weight，SDW)。計算鮮重根冠比(root-shoot ratio of fresh weight，R/S-FW)和干重根冠比(root-shoot ratio of dry weight，R/S-DW)。

發(fā)芽勢(%)=(培養(yǎng)第4天發(fā)芽數(shù)/ 50)×100。

發(fā)芽率(%)=(培養(yǎng)第10天發(fā)芽數(shù)/ 50)×100。

耐鹽系數(shù)=鹽脅迫指標平均值/對照指標平均值。

萌發(fā)指數(shù)=(1.00)nd4+(0.75)nd6+(0.50)nd8+(0.25)nd10(式中：nd4、nd6、nd8、nd10分別為第4、6、8、10 d的種子發(fā)芽率；1.00、0.75、0.50、0.25分別為相應萌發(fā)天數(shù)所賦予的系數(shù)[14]。

各指標的耐鹽系數(shù)以其英文縮寫前加R(relative)表示，如以RGP(relative germination potential，RGP)表示發(fā)芽勢耐鹽系數(shù)。

1.3 耐鹽性綜合評價

以供試材料的各耐鹽相對指標為依據(jù)，計算加權(quán)隸屬函數(shù)，并根據(jù)加權(quán)隸屬函數(shù)值(D值)進行聚類分析[15]。公式如下：

μ(Xi)=(Xi-Xi min)/(Xi max-Xi min)

式中，Xi為各供試材料基于鑒定指標i的耐鹽系數(shù)，Ximax、Ximin分別為供試材料中Xi的最大值和最小值，μ(Xi)為各供試材料Xi的隸屬函數(shù)值，CVi為各供試材料μ(Xi)的變異系數(shù)，Wi表示CVi在總變異中所占比率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2007整理試驗數(shù)據(jù)，使用SPSS Statistics 17.0進行多元統(tǒng)計分析，用Pearson法進行相關(guān)性分析[16]，K-均值聚類法進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫對苜蓿種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

參試苜蓿種質(zhì)材料萌發(fā)期鑒定指標的方差分析顯示，除苗鮮重和苗干重外，其余11項鑒定指標在不同種質(zhì)間和不同處理下均存在極顯著的差異(表2)，說明150 mmol·L-1NaCl溶液能夠有效地區(qū)分不同種質(zhì)材料的耐鹽性。

表2 苜蓿種質(zhì)材料萌發(fā)期性狀的方差分析(F檢驗值)Table 2 Variance analysis of germination traits in alfalfa varieties (F-test value)

注：*表示在0.05水平上顯著相關(guān)；**表示在0.01水平上顯著相關(guān)，下同

Note:*indicates significant correlation at the 0.05 level;**indicates significant correlation at the 0.01 level, the same as below

由表3可知，與正常條件相比，13項鑒定指標在150 mmol·L-1NaCl溶液下的平均值均呈不同程度的下降，其中下降最大的為發(fā)芽勢(64.4%)，其次為萌發(fā)指數(shù)(54.4%)與發(fā)芽率(46.2%)，下降最小的為苗鮮重(1.5%)，其次為苗干重(2.4%)和總干重(9.3%)。說明150 mmol·L-1濃度的NaCl溶液對苜蓿種子的萌發(fā)和幼苗的生長均有一定的抑制作用。從鮮重指標看，對照(蒸餾水)中的根鮮重和苗鮮重分別為60.20 mg、162.05 mg，鹽脅迫下的根鮮重和苗鮮重分別為41.22 mg、159.69 mg，鹽脅迫對根鮮重和苗鮮重的抑制率分別為31.53%和1.15%，說明鹽脅迫對根的抑制大于苗。從參試材料看，所有材料的發(fā)芽勢和萌發(fā)指數(shù)均受到抑制；發(fā)芽率除‘新牧2號’的發(fā)芽率略有下降，‘綠苜1號’的發(fā)芽率持平，其余所有材料的發(fā)芽率都呈減小趨勢；‘榆次’、‘河西’等14個種質(zhì)的根長呈上升趨勢，其余呈下降趨勢；‘蔚縣’、‘肇東’等4個種質(zhì)的苗高

呈上升趨勢，其余呈下降趨勢。根鮮重、根干重、苗鮮重、苗干重、鮮重根冠比、干重根冠比、總鮮重和總干重分別有98，104，58，60,102，113，91和87個材料呈下降趨勢。說明不同種質(zhì)間受鹽脅迫抑制程度存在差異。

表3 苜蓿種質(zhì)材料在鹽脅迫和正常條件下的種子萌發(fā)和幼苗生長情況Table 3 Seed germination and seedling growth of alfalfa varieties under salt stress and distilled water

2.2 苜蓿種質(zhì)材料據(jù)單項指標的耐鹽差異

不同苜蓿種質(zhì)材料在基于13個鑒定指標的耐鹽系數(shù)上都有不同的表現(xiàn)，其變異系數(shù)最大為58.74%(RGP)，最小為23.15%(RTFW)。在分別以13項單個鑒定指標為依據(jù)的種質(zhì)耐鹽性排序不一致，如‘矩苜蓿’在干重根冠比指標中耐鹽性最好，但是在苗干重指標中的耐鹽性卻最差(表4)。因此，依據(jù)任一單項耐鹽系數(shù)都不能全面、有效地評價不同苜蓿材料的耐鹽性，綜合考察這些指標的評價是必要的。

表4 基于不同鑒定指標的耐鹽系數(shù)Table 4 Coefficient of salt tolerance based on different identification indices

2.3 各指標耐鹽系數(shù)的隸屬函數(shù)值與D值間的相關(guān)性分析

以各指標的相對耐鹽系數(shù)為依據(jù)，利用加權(quán)隸屬函數(shù)法得到了120個苜蓿種質(zhì)各指標耐鹽系數(shù)的隸屬函數(shù)值(表5)。就平均值而言，μ(RTDW)最大，μ(RSH)最?。煌ㄟ^變異系數(shù)的比較表明，μ(RSDW)和μ(RTDW)在種質(zhì)間的差異最小，μ(RR/S-FW)在種質(zhì)間的差異最大；在權(quán)重方面，μ(RGP)和μ(RR/S-FW)的權(quán)重最大，μ(RSDW)與μ(RTDW)的權(quán)重最小。

表5 苜蓿種質(zhì)基于13種耐鹽系數(shù)的隸屬函數(shù)值Table 5 Membership function values of alfalfavarieties based on thirteen kinds of salt tolerant coefficient

供試120個苜蓿種質(zhì)的D值變化范圍為0.1510～0.7212。相關(guān)性分析表明，D值與全部指標隸屬函數(shù)均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系；萌發(fā)性狀間(RGP、RGR、RGI)全部呈極顯著正相關(guān)；萌發(fā)性狀與苗期性狀間也多呈極顯著正相關(guān)(表6)。說明D值可以綜合評價苜蓿萌發(fā)期耐鹽性，并且D值越大對應材料的耐鹽性越強。μ(RGP)、μ(RGR)、μ(RGI)、μ(RRFW) 4項指標與D值都呈極顯著正相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)較大(0.783，0.786，0.824，0.819)，說明發(fā)芽勢、發(fā)芽率、萌發(fā)指數(shù)、根鮮重與萌發(fā)期耐鹽性的關(guān)系最為密切，其中萌發(fā)指數(shù)隸屬函數(shù)值與D值相關(guān)性最大(0.824)。

表6 基于各指標的耐鹽系數(shù)的隸屬函數(shù)值與D值的相關(guān)性分析Table 6 Correlation analysis of the D value with membership function values based on salt tolerant coefficient of identification indices

2.4 苜蓿萌發(fā)期耐鹽性的綜合評價

根據(jù)供試苜蓿種質(zhì)材料的D值，采用K-均值聚類法對供試苜蓿種質(zhì)進行聚類分析，120個苜蓿種質(zhì)材料可被分為5個類群，依據(jù)D值大小分別歸為5個耐鹽性級別(表7)。首領等11個材料(9.2%)為高耐鹽級(1級)，巨能801等24個材料(20.0%)為耐鹽級(2級)，固原等38個材料(31.6%)為中等級(3級)，莎車等36個材料(30.0%)為敏鹽級(4級)，伊犁等11個材料(9.2%)對高敏鹽級(5級)。以上分級符合正態(tài)分布，因而這種分級是合理的。總體來看，屬于耐鹽性1級和2級的35個材料都具有較大的耐鹽系數(shù)(0.5以上)。

表7 基于D值對120個苜蓿種質(zhì)耐鹽性的分級結(jié)果Table 7 Classification of salt tolerance of 120 alfalfa varieties based on the D value

3 討論

3.1 關(guān)于NaCl脅迫對苜蓿種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

在鹽濃度選擇上，本研究選用150 mmol·L-1NaCl溶液進行耐鹽篩選。韓清芳等[17]用0.3%、0.7%、1.0%質(zhì)量濃度的NaCl溶液分別對19個苜蓿種質(zhì)進行處理，結(jié)果表明用0.7%、1.0%的NaCl溶液進行苜蓿種子萌發(fā)期耐鹽性鑒定較為合理。這與我們選擇的濃度(150 mmol·L-1約與0.87%質(zhì)量濃度相當)水平相近，此濃度達到重度鹽堿水平。本試驗中鹽溶液對苜蓿的萌發(fā)和幼苗的生長均有一定的抑制作用，鹽脅迫對根的抑制大于苗，這一研究結(jié)果與已有的研究結(jié)果一致[18-19]。與其他作物比較，我們的研究結(jié)果與水飛薊對鹽脅迫的反應相似[20]，但與扁蓿豆對鹽脅迫的研究結(jié)果不同，扁蓿豆幼苗在鹽脅迫下芽長比根長下降更多[21]。這可能是因作物不同，對鹽害的敏感時期也不同，因此要根據(jù)具體作物來確定合適的鑒定指標。關(guān)于萌發(fā)期和幼苗期耐鹽是否相關(guān)，于潔等[22]研究表明，苜蓿種子萌發(fā)和幼苗生長之間存在顯著相關(guān)性。本研究表明，萌發(fā)性狀與苗期性狀間多呈極顯著正相關(guān)，說明苜蓿萌發(fā)期的耐鹽性至少與幼苗早期的耐鹽性是高度相關(guān)的，但是否影響幼苗后期的相關(guān)耐鹽性能需待進一步研究。

3.2 萌發(fā)期耐鹽性的綜合評價

前人對苜蓿耐鹽性進行評價方法各異。常俊等[23]根據(jù)相對出苗率及鹽濃度之間的相關(guān)性進行耐鹽性評價。李源等[24]利用標準差系數(shù)賦予權(quán)重法對紫花苜蓿種質(zhì)耐鹽性進行綜合評價。而采用隸屬函數(shù)值法可以確定各鑒定指標的變異系數(shù)及權(quán)重，直觀表明各項鑒定指標耐鹽性所占比率，全面、準確地評價種質(zhì)的耐鹽性[25]。本研究中，依據(jù)每個鑒定指標對種質(zhì)耐鹽的排序各異，這印證了選用多個鑒定指標的必要性。本研究發(fā)現(xiàn)，萌發(fā)指數(shù)耐鹽系數(shù)與D值呈極顯著正相關(guān)，說明萌發(fā)指數(shù)耐鹽系數(shù)在耐鹽性鑒定指標中具有重要作用，建議在苜蓿耐鹽種質(zhì)篩選時，將萌發(fā)指數(shù)作為一個簡單而有效的指標[26]。

3.3 萌發(fā)期耐鹽種質(zhì)篩選

以往對苜蓿種質(zhì)的耐鹽性所做的研究，受所選材料限制，其篩選結(jié)果不一[6,8-10]。本研究對120個中外苜蓿種質(zhì)材料進行綜合評價，根據(jù)D值將其分為高耐鹽、耐鹽、中等、敏鹽和高敏鹽5個類群。首領等11個苜蓿種質(zhì)屬于高耐鹽類群，巨能801等24個苜蓿種質(zhì)屬于耐鹽類群。建議將這些苜蓿種質(zhì)在進一步田間篩選后作為耐鹽材料在鹽堿地推廣利用。同時這些材料也可以作為苜蓿耐鹽育種的重要親本材料。在高耐鹽和耐鹽等級的35個材料中，無棣苜蓿、WL324、中苜3號等種質(zhì)在黃河三角洲等鹽堿地種植廣泛，這些種質(zhì)耐鹽堿能力并不是最高的(2級)，原因可能是生產(chǎn)中要考慮耐鹽能力和高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等性狀的相互協(xié)調(diào)。

4 結(jié)論

150 mmol·L-1的鹽溶液對苜蓿的種子萌發(fā)和幼苗生長均有一定的抑制作用，種子萌發(fā)比幼苗生長受抑制程度更大；鹽脅迫對根的抑制大于苗。

不同苜蓿品種的耐鹽性差異顯著，通過加權(quán)隸屬函數(shù)法可以綜合評價苜蓿萌發(fā)期耐鹽性，根據(jù)加權(quán)隸屬函數(shù)值和聚類分析，可將120個種質(zhì)分為耐鹽性不同的5個級別，其中‘首領’、‘山雀’、‘新牧2號’、‘勞博’等11個品種的耐鹽性能最佳。