許英一， ，

(1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2. 黑龍江省普通高校農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006； 3. 黑龍江省畜牧研究所， 黑龍江 齊齊哈爾161005)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)為多年生豆科牧草，是重要的飼料作物。分布廣泛，產(chǎn)草量高，營養(yǎng)豐富，適口性好，適應(yīng)性強，被稱為“牧草之王”[1]。紫花苜蓿中含有植物葉蛋白、皂苷、黃酮類、類胡蘿卜素、酚醛酸等多種生物活性成分，因此，苜蓿在抗衰老、抗菌、抗病毒、抗癌、抗腫瘤、護肝、抑制高血壓、高血脂、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)、增強機體免疫力、預(yù)防心血管疾病及止痛鎮(zhèn)痛等方面都具有良好的作用[2-3]。同時黃酮類化合物也是重要的功能食品添加劑、飼料添加劑[4]、天然抗氧化劑, 具有保鮮和護膚美容作用[5]。

目前，人們對大豆、辣木(MoringaoleiferaL.) 等植物中黃酮類化合物的提取及抗氧化性進行了大量研究，而對紫花苜蓿提取及抗氧化性研究很少。岳愛琴等[6]采用有機溶劑法提取大豆中異黃酮，得率為9.18%；岳秀潔等[7]采用超聲提取辣木葉黃酮，得率為(48.93±0.44)mg·g-1；張詠梅等[8]采用微波輔助提取苜蓿黃酮，黃酮得率僅為4.92mg·g-1，限制了苜蓿黃酮在食品生產(chǎn)中的應(yīng)用和其抗氧化性等功能特性的研究。提取黃酮的方法有溶劑浸提法、微波提取法、超臨界 CO2萃取法、纖維素酶法、超聲波提取法等[9]。近年來，超聲波提取技術(shù)被廣泛用來萃取植物中的生物堿、苷類、生物活性物質(zhì)、動物組織漿的毒質(zhì)等[10-11]。該技術(shù)具有能耗低、效率高、不破壞有效成分的特點。本研究旨在采用對超聲波輔助提取苜蓿葉黃酮工藝條件進行優(yōu)化，并對提取的總黃酮進行抗氧化性能的研究。為進一步研究和開發(fā)利用紫花苜蓿黃酮類化合物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

紫花苜蓿，黑龍江省畜牧研究所提供。DPPH，美國sigma公司；蘆丁標準品，中國藥品生物制品檢定所；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

722N 可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；BS224S 電子天平， 北京賽多利斯科學儀器有限公司；KQ-300DE 超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；WK-600高速藥物粉碎機，青州市精誠機械有限公司；日立CR21G高速冷凍離心機，天美(中國)科學儀器有限公司；HHS21-4 電熱恒溫水浴鍋，上海躍進醫(yī)療器械廠。

1.2 試驗方法

1.2.1提取方法

(1)乙醇浸提法 準確稱取 5.0 g 經(jīng)過處理的紫花苜蓿葉粉末置于 500 mL 錐形瓶中，加入 80% 的乙醇 100 mL 回流浸提3 h，收集浸提液，濾渣重復(fù)浸提1次，合并2次的浸提液，測定總黃酮得率。

(2)超聲波輔助水提取法 準確稱取 5.0 g 經(jīng)過處理的紫花苜蓿葉粉末置于 250 mL 錐形瓶中，加入 100 mL 蒸餾水，在溫度為60℃、超聲功率為180 w的條件下超聲提取 30 min，收集浸提液，濾渣重復(fù)浸提1次，合并2次的浸提液，測定總黃酮得率。

(3)超聲波輔助乙醇提取法 準確稱取 5.0 g 經(jīng)過處理的紫花苜蓿葉粉末置于 250 mL 錐形瓶中，加入100 mL 80% 的乙醇，在溫度為60℃、超聲功率為180 w的條件下超聲提取30 min，收集浸提液，濾渣重復(fù)浸提1次，合并2次的浸提液，測定總黃酮得率。

1.2.2超聲波輔助乙醇提取紫花苜蓿葉總黃酮的工藝優(yōu)化

(1)單因素試驗

準確稱取5.0 g 經(jīng)過處理的紫花苜蓿葉粉末，固定料液比1:20(g·mL-1)，以乙醇體積分數(shù)80%，提取溫度50℃，提取時間30 min，超聲功率180 w為單因素試驗的基礎(chǔ)條件。但研究某一因素時，其他條件保持不變。乙醇體積分數(shù)分別為 60%，70%，80%，90%，100%，提取溫度分別為20，30，40，50，60 ℃，提取時間分別為10，20，30，40，50 min，超聲功率分別為120，150，180，210，240 w，按上述設(shè)計做單因素試驗。所得浸提液按標準曲線處理方法測定吸光度，計算總黃酮得率，每組3次重復(fù)。

(2)正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用 L16(45)正交試驗對紫花苜蓿葉總黃酮的提取條件進行優(yōu)化，設(shè)定正交試驗因素水平，見表1。

1.2.3苜蓿葉總黃酮類化合物的測定

(1)標準曲線繪制

按照白吉慶等[12]文獻中的方法，以蘆丁為標準品，采用 NaNO2/Al( NO3)3顯色法，繪制標準曲線。以吸光值為縱坐標，蘆丁質(zhì)量濃度(C，mg·mL-1)為橫坐標繪制蘆丁標準曲線，得線性回歸方程為y=11.025x+0.011，R2=0.9990，表明在0.02～0.1 mg·mL-1范圍內(nèi)溶液吸光度和蘆丁對照品的質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。

(2)苜蓿葉總黃酮含量測定

吸取一定體積苜蓿葉黃酮提取液，按照繪制標準曲線同樣方法測定苜蓿葉黃酮的吸光度。根據(jù)標準曲線回歸方程計算得到總黃酮質(zhì)量濃度(C)，按公式(1)計算樣品中總黃酮得率(P)。

(1)

式(1)中，C—由標準曲線計算得出的質(zhì)量濃度(mg·mL-1)；N—提取液稀釋倍數(shù)；V—苜?？傸S酮原液的總體積(mL)；m—苜蓿原料質(zhì)量(g)。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiments

1.2.4抗氧化活性測定

(1) DPPH自由基清除率的測定

參照Shimada[13]的方法略做調(diào)整。分別取稀釋后不同濃度樣液2 mL于試管內(nèi)，加入0.04 g·L-1的DPPH自由基無水乙醇溶液2 mL，混合均勻，避光30 min，在517 nm處測得的吸光值記為Ai。另取樣液2 mL放于試管中，加入2 mL無水乙醇，避光反應(yīng)20 min，在517 nm下測定的吸光值記為Aj。用0.04 g·L-1的無水乙醇溶液2 mL與無水乙醇2 mL反應(yīng)作為參比，吸光值記為A0。同時以VC做陽性對照，計算公式為：

(2)

(2) 還原力的測定

參照Oyaizu[14]的方法略做改動。取2.0 mL稀釋后不同濃度樣液于試管中，分別加入0.2 mol·L-1pH6.6的磷酸鹽緩沖液2.0 mL，質(zhì)量分數(shù)1%的鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]溶液2.0 mL，混勻，在50 ℃水浴下保溫20 min，再加入質(zhì)量分數(shù)10%的三氯乙酸(TCA)溶液2.0 mL，震蕩搖勻后以4 000 r·min-1離心10 min。取離心后上清液2.5 mL，加入2.5 mL去離子水和0.5 mL質(zhì)量分數(shù)為0.1% 的FeCl3溶液，震蕩搖勻后在50℃水浴下保溫10 min，在700 nm下進行比色，以去離子水作為空白，同時以VC做陽性對照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件對所測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，所有試驗均重復(fù)3次，各實驗數(shù)據(jù)均以平均值和標準誤差表示測定結(jié)果，對正交試驗設(shè)計進行方差分析，并用Duncan 法對各測定數(shù)據(jù)進行多重比較，不同字母表示組間比較差異顯著；采用Excel 制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法比較

3種提取方法對黃酮提取效果的影響結(jié)果如圖1 所示，3種提取方法中，超聲波輔助乙醇法提取苜蓿葉總黃酮得率較高，且與另外2種方法總黃酮得率相比，均具有顯著性差異(P<0.05)，因此選擇超聲波輔助乙醇法進行后續(xù)優(yōu)化試驗。

圖1 提取方法的比較Fig.1 Comparison of extraction method注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)Note：Different letters indicate significant differences at the 0.05 level

2.2 單因素試驗結(jié)果

各因素對對總黃酮得率的影響如圖2所示，4個因素對總黃酮得率的影響均具有顯著性差異(P<0.05)。單因素試驗結(jié)果表明：最佳乙醇體積分數(shù)為80%；最佳提取溫度為50℃；最佳提取時間為30 min；最佳超聲功率為180 w。

圖2 4個因素對總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of four different factors on total flavonoid yield注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)Note: Different letters indicate significant differences at the 0.05 level

2.3 正交試驗結(jié)果、方差分析及多重比較

由表2 可知，通過極值 R 大小得出各因素對苜蓿葉總黃酮得率影響的順序為：提取溫度>超聲功率>乙醇體積分數(shù)>提取時間。 由表 3 方差分析得出：提取溫度、超聲功率、乙醇體積分數(shù)對總黃酮得率的影響差異極顯著(P<0.01)，乙醇體積分數(shù)的影響顯著(P< 0.05)。由表 4 多重比較分析得出：苜蓿葉總黃酮最佳工藝參數(shù)為A1B4C2D3。

表2 正交設(shè)計結(jié)果Table 2 The results of orthogonal design

表3 正交設(shè)計方差分析表Table 3 The variance analysis form of orthogonal design

注：*表示顯著(P<0.05)；**表示極顯著(P<0.01)

Note: * indicates significant at the 0.05 level；**indicates extremely significant at the 0.01 level

表4 乙醇體積分數(shù)、提取溫度、提取時間、超聲功率4因素多重比較結(jié)果(SSR法)Table 4 The multiple comparison results of 4 factors on the ethanol volume fraction，extraction temperature，extractiontime and ultrasonic power(SSR Methods)

2.4 驗證試驗

準確稱取一定量苜蓿粉末3份，按上述最佳工藝參數(shù),即A1B4C2B3超聲提取，測定吸光度，得到苜?？傸S酮得率為6.43 mg·g-1，大于正交試驗中16個工藝參數(shù)的結(jié)果，即A1B4C2D3為最佳工藝參數(shù)，此時苜蓿總黃酮得率為6.43 mg·g-1。

2.5 總黃酮抗氧化活性分析

2.5.1苜?？傸S酮對DPPH 自由基清除作用 苜蓿黃酮及抗壞血酸對DPPH自由基清除率結(jié)果如圖6、圖7所示。從圖6可以看出，在苜?？傸S酮的劑量為0.2 ～1.0 mg·mL-1范圍內(nèi)呈一定的劑量效應(yīng)，隨著苜蓿黃酮的濃度的增大，對DPPH自由基清除率呈現(xiàn)增大趨勢。通過對數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析可以得出黃酮質(zhì)量濃度與清除率的回歸方程為y=71.57x+17.51 (R2=0.9863)，其半抑制濃度(IC50值)為0.608 mg·mL-1；陽性對照Vc的濃度增大，其抑制率也增大，Vc的質(zhì)量濃度與清除率的回歸方程為y=8.0745x+19.139 (R2= 0.9717)，Vc在濃度很低時就體現(xiàn)出了抑制性，其半抑制濃度(IC50值為4.952 μg·mL-1)，由此可看出在同等質(zhì)量的條件下苜蓿總黃酮的抑制率低于Vc的抑制率。DPPH自由基清除率苜蓿葉總黃酮相當于Vc的量即Vc當量為8.145 μg·mg-1。

圖6 苜蓿葉總黃酮對DPPH自由基清除率Fig.6 DPPH radical scavenging capacity oftotal flavonoids from alfalfa leaf

圖7 Vc對DPPH自由基清除率Fig.7 DPPH radical scavenging capacity of Vc

2.5.2苜?？傸S酮的還原力 苜?？傸S酮及抗壞血酸的還原力測定結(jié)果如圖8、圖9所示。苜蓿葉總黃酮和Vc的還原能力隨著質(zhì)量濃度的增大而增強，且呈明顯的量效關(guān)系。雖然其還原力低于Vc，但還是表現(xiàn)出了較強的還原力。

圖8 苜蓿葉總黃酮的還原力Fig.8 Reducing power of total flavonoidsfrom alfalfa leaf

圖9 Vc的還原力Fig.9 Reducing power of Vc

3 討論與結(jié)論

3.1 提取方法的選擇

黃酮類化合物的制備方法主要有水提取法、有機溶劑提取法、二氧化碳超臨界流體萃取法、超聲波輔助提取法等。水提法提取率較低，提取液易腐敗變質(zhì)，且后續(xù)的過濾、干燥除去溶劑等操作困難；有機溶劑提取法克服了水提法產(chǎn)物存放易霉變等缺點，提取率高，這與蛋白質(zhì)等雜質(zhì)在乙醇中難溶或微溶有關(guān)。后續(xù)的干燥、過濾等操作也比較容易進行；超聲波輔助提取技術(shù)，因具有提取時間短、提取效率高、節(jié)約成本等優(yōu)點[15]，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于很多植物黃酮的提取。最常見的黃酮類化合物的提取方法是有機溶劑提取法，目前也有一些文獻采用超聲波輔助乙醇提取法，但采用超聲波輔助水提取法提取黃酮類化合物的還未見報道。本試驗比較了乙醇浸提法、超聲波輔助水提取法和超聲波輔助乙醇提取法3種方法的總黃酮得率，分別為(4.23±0.08)mg·g-1、(4.59±0.08)mg·g-1和(5.44±0.12)mg·g-1，超聲波輔助乙醇提取法的總黃酮得率最高，且與另2種方法總黃酮得率相比，均具有顯著差異。因此采用超聲波輔助乙醇提取法。優(yōu)化試驗結(jié)果表明超聲波輔助乙醇提取苜蓿葉總黃酮的最佳工藝為：乙醇體積分數(shù) 70%、提取溫度 60 ℃、提取時間 30 min、超聲功率180 w，苜蓿葉總黃酮得率為6.43 mg·g-1，得率顯著高于趙婭敏等[16]超聲輔助提取甘肅紫花苜蓿黃酮得率(1.7643 mg·g-1)，同時也高于劉香萍等[17]超聲輔助提取紫花苜蓿葉黃酮得率(5.29 mg·g-1)。關(guān)于苜蓿葉總黃酮的研究及其分離純化目前已經(jīng)取得初步進展，本研究僅對苜蓿葉總黃酮提取方法的優(yōu)化進行了初步的探討，為后續(xù)苜蓿葉總黃酮的分離純化提供技術(shù)支撐，而苜蓿葉總黃酮的主要成分的分離以及藥用價值有待于做進一步驗證。

3.2 苜蓿葉總黃酮抗氧化活性

黃酮類化合物除作為藥品用于臨床[18]，還可作為食品、化妝品等的天然添加劑，已有研究以黃酮為功能指標，研制和開發(fā)了山楂葉黃酮的保健類產(chǎn)品，具有很好的發(fā)展前景。DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基，在可見光區(qū)有特征吸收，比色測定簡便、快捷。當自由基清除劑存在時，DPPH·的單電子被配對而使乙醇溶液顏色變淺，最大吸收波長處的吸光度變小，且顏色變淺的程度與配對電子數(shù)呈劑量關(guān)系，因此可用于物質(zhì)清除自由基的研究與天然抗氧化劑的篩選[19]。超聲波輔助提取的苜蓿葉總黃酮對DPPH·清除率可達85.76%，這與朱宇旌等[20]研究表明的苜蓿黃酮具有較強的抗氧化性的結(jié)果相一致；苜蓿葉總黃酮清除DPPH·的 Vc當量為8.145 μg·mg-1。還原力是評價物質(zhì)抗氧化活性的重要指標，該方法的機理是抗氧化劑將Fe3+還原成Fe2+的形式，從而中斷自由基的鏈式反應(yīng)。還原能力的大小可以通過在波長700 nm處的吸光度來檢測，吸光度越大還原力越大，抗氧化能力越強[21]。當苜蓿葉總黃酮的濃度為1 mg·mL-1時，其還原力達0.82，但不及VC。苜蓿葉總黃酮抗氧化能力隨著質(zhì)量濃度的升高逐漸增強，但不及VC,這一點與胡衛(wèi)成[22]研究表明的蓮蓬殼具有較強的抗氧化性的結(jié)果相一致。說明超聲提取的苜蓿葉總黃酮具有較好的抗氧化活性，可用作天然的抗氧化劑原料。該研究也為苜蓿葉總黃酮資源的進一步綜合利用提供了重要依據(jù)。