， ， ， ，

(甘肅農業(yè)大學草業(yè)學院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅省草業(yè)工程實驗室，甘肅 蘭州730070)

通過礦產開采、金屬冶煉、化工、煤和石油的燃燒、火山、巖石風化、污水排放、農藥和化肥施用、大氣沉降等途徑，重金屬源源不斷地進入生物圈中[1]。隨著城市化進程加快，長期的生產過程不可避免地向環(huán)境排放“三廢”等污染物質，從而對土壤造成較為嚴重的重金屬污染[2-4]。近年來，重金屬污染問題日益加劇，銅、鎘、鉛作為主要的重金屬污染成分已被國內外廣泛關注[5-8]。銅是植物生長發(fā)育必需的營養(yǎng)元素之一，但過量的銅會抑制植物光合作用，且引發(fā)葉色失綠，從而抑制植株生長[9-11]。鎘不是植物的必需元素，而且對植物的生長有著不利影響，植物體內的鎘元素積累達到一定濃度就會表現出毒害，如阻礙植物根系的生長或者抑制其水分和養(yǎng)分的吸收等[12]。鉛是常見的有毒元素，會阻礙植物的生長發(fā)育，主要表現為葉片表面的黃化、枯萎和植株的矮小，從而降低作物產量和質量[13]。因此，針對土壤重金屬污染修復的研究對環(huán)境保護和農牧業(yè)生產具有重要意義。

目前，重金屬污染土壤的處理方式很多，主要有化學治理、物理處理、生物修復等方式?；瘜W和物理治理的措施有很多種，但是這些方法都只能在短期內降低重金屬在土壤中的毒性及生物有效性，是一種原位修復方法，并沒有真正意義上的清除重金屬，而且有再次造成污染的潛在可能，且其治理成本昂貴[12,14]。植物修復方法是利用植物將環(huán)境介質中的有毒有害的污染物轉移、轉化或容納，從而達到治理的效果。植物修復不但更加環(huán)保，而且治理費用低[12]。

禾本科草類植物黑麥(Secalecereale)、燕麥(Avenasativa)、高丹草(Sorghumbicolor×Sorghumsudanense)、玉米(Zeamays)、無芒雀麥(Bromusinermis)、垂穗披堿草(Elymusnutans)、黑麥草(Loliumperenne)、高羊茅(Festucaarundinace)是我國北方重要的栽培牧草，具有適應性強、生長快、生物量大的特點，是干旱區(qū)生態(tài)恢復和水土保持的極好材料。目前，關于植物耐受重金屬脅迫的研究較多，但主要針對某一種或兩三種植物，而禾草種子萌發(fā)及幼苗生長受重金屬脅迫方面仍缺乏系統(tǒng)研究。種子萌發(fā)和幼苗生長期是植物對環(huán)境脅迫較為敏感的時期[15]，種子在脅迫條件下萌發(fā)與幼苗生長的特征可以在一定程度上反映植物對脅迫的耐性[16]。據此，本研究選擇上述8種禾本科植物為材料，探討了重金屬銅、鎘、鉛離子對種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，以期為篩選出對重金屬離子有較強耐受力的牧草提供研究基礎，并為治理重金屬污染提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試8份材料種子品種名稱及來源見表1。

1.2 試驗設計

重金屬離子濃度依據高菲菲[17]和陳偉等[18]設定，利用硫酸銅、硝酸鎘和硝酸鉛配置Cu2+(200、300、400和500 mg·L-1)，Cd2+(1、50、150和200 mg·L-1)和Pb2+(500、1 000、1 500和2 000 mg·L-1)溶液。后用配好的不同濃度的重金屬離子溶液處理8種禾草種子，每個處理重復4次，同時設置對照。在洗凈烘干的培養(yǎng)皿(直徑15 cm)中鋪雙層濾紙下墊一層脫脂棉，分別加入上述濃度溶液10 ml，對照組用蒸餾水，每個培養(yǎng)皿中均勻置入50粒種子，萌發(fā)條件為20℃恒溫，8 h光照(750～1 250 Lx)，16 h黑暗。每天定時記錄種子發(fā)芽數[19](以胚根露白為標準)，并用電子天平稱量補充因蒸發(fā)散失的水分。第7 d從每個處理中取生長均勻一致的10株幼苗測量根芽長，再將根芽風干后測定重量。

表1 8份禾本科草種子來源Table 1 The sources of 8 grasses

1.3 測定指標及方法

發(fā)芽率(%)=發(fā)芽種子數/供試種子數×100%；

相對發(fā)芽率(%)=處理濃度發(fā)芽數/對照發(fā)芽數×100%；

發(fā)芽指數(GI)=∑(Gt/Dt)(Gt為第t天的發(fā)芽數，Dt為相應的發(fā)芽天數)；

相對發(fā)芽指數=處理濃度發(fā)芽指數/對照發(fā)芽指數；

活力指數(VI)=GI×S(GI為發(fā)芽指數，S為第7 d的幼苗長度)；

相對活力指數=處理濃度活力指數/對照活力指數；

相對胚根長=處理濃度胚根長/對照胚根長；

相對胚芽長=處理濃度胚芽長/對照胚芽長；

相對根重=處理濃度根重/對照根重；

相對芽重=處理濃度芽重/對照芽重。

應用隸屬函數法對8種禾本科草類植物種子萌發(fā)期抗Cu2+、Cd2+、Pb2+性進行綜合評價。先利用公式X(μ)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)分別計算每份材料相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽指數、相對活力指數、相對根長、相對芽長、相對根重和相對芽重在不同Cu2+、Cd2+、Pb2+下的具體隸屬函數值[20]。式中，X為參試植物某一抗性指標的測定值，Xmax和Xmin分別為所有材料中該指標的最大值和最小值，然后把每一指標在不同Cu2+、Cd2+和Pb2+下濃度的隸屬值累加求平均值，最后把每份材料各抗性項指標隸屬函數值累加求平均值，根據各材料平均隸屬函數值大小確定其萌發(fā)期抗Cu2+、Cd2+、Pb2+的強弱，平均值越大，抗性越強；反之，抗性越弱。

1.4 數據分析

種子發(fā)芽數值均用柱狀圖表示，幼苗生長數值均以平均值±標準誤表示，使用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，通過LSD法檢驗各處理間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 Cu2+對8種禾本科草種子發(fā)芽和幼苗生長的影響

隨著Cu2+濃度的增大，供試8種植物種子相對發(fā)芽率、發(fā)芽指數和活力指數，幼苗的相對芽長、相對根長、相對芽重和相對根重均呈不同程度的降低趨勢(圖1、表2)。

2.1.1Cu2+對8種禾本科草種子發(fā)芽的影響 各Cu2+濃度處理間，玉米、黑麥、燕麥和高丹草種子的相對發(fā)芽率均在90%以上，各處理間無顯著的差異，而垂穗披堿草、無芒雀麥、黑麥草和高羊茅種子的相對發(fā)芽率隨Cu2+濃度的增大呈降低趨勢(圖1A)。各Cu2+濃度處理下，玉米、黑麥和高丹草的相對發(fā)芽指數在0.8～1.0之間，垂穗披堿草、無芒雀麥、黑麥草和高羊茅種子的相對發(fā)芽指數顯著下降，且均低于0.5，而400、500 mg·L-1Cu2+處理下燕麥的相對發(fā)芽指數低于0.8(圖1B)。隨著Cu2+濃度的增大，供試8種材料的相對活力指數均呈降低趨勢，在500 mg·L-1Cu2+濃度下，高羊茅不發(fā)芽(圖1C)。供試各Cu2+濃度下，玉米、燕麥、高丹草和黑麥種子的相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽指數和相對活力指數均顯著高于黑麥草、無芒雀麥、垂穗披堿草和高羊茅。

圖1 不同濃度Cu2+對8種禾本科草種子相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽指數和相對活力指數的影響Fig.1 Effects of different Cd2+concentration on the seed relative germination rate, relative germination index and relative vigor index of 8 grasses

2.1.2Cu2+對8種禾本科草種子幼苗生長的影響 供試各Cu2+濃度下，玉米、燕麥和黑麥的相對芽長和相對芽重均無顯著性差異(P>0.05)。垂穗披堿草、黑麥草和無芒雀麥在低濃度處理下的相對芽長和相對芽重顯著高于高濃度處理。高羊茅只有在200 mg·L-1Cu2+下才有芽，其他3種濃度下種苗無芽(表2)。供試各Cu2+濃度下的高丹草相對芽長均顯著高于玉米和燕麥(P<0.05)；上述3種草種的相對芽長均顯著高于黑麥、無芒雀麥、黑麥草、垂穗披堿草和高羊茅(表2)。玉米、燕麥、高丹草和無芒雀麥相對芽重均顯著高于黑麥、黑麥草、垂穗披堿草和高羊茅(P<0.05)。隨著Cu2+濃度的增大，高丹草的相對芽重逐漸增大，與其相對芽長呈一致的變化趨勢。200 mg·L-1Cu2+下玉米相對根長顯著高于300、400和500 mg·L-1處理(P<0.05)。供試各Cu2+濃度下，玉米、燕麥和黑麥相對根長顯著高于高丹草(表2)。黑麥相對根重顯著高于玉米、燕麥和高丹草，前4者均顯著高于垂穗披堿草、無芒雀麥、黑麥草和高羊茅(P<0.05)(表2)。400、500 mg·L-1Cu2+下，高丹草、黑麥草、垂穗披堿草、無芒雀麥和高羊茅均無根。相對其他6種草種來說，重金屬Cu2+處理對黑麥草和高羊茅幼苗生長的抑制作用較強。

表2 不同濃度Cu2+對8種禾草種子相對芽長、相對根長、相對芽重和相對根重的影響Table 2 Effects of different Cu2+ concentration on the seed relative bud length, relative root length, relative shoot weight and relative root of 8 grasses

注：同列不同小寫字母表示同一材料在不同處理間差異顯著(P<0.05) ，同行不同大寫字母表示同一處理下不同材料間差異顯著(P<0.05)；“一”表示在處理下幼苗沒有生長，下同

Note：Different lowercase letters within the same column indicate significant difference between the same materials in different treatmentat the 0.05 level; Different capital letters indicate significant difference between different materials under the same processing at the 0.05 level; ＂—＂indicates no growth of seedlings under treatment, the same as below

2.1.38種禾本科草種子萌發(fā)期耐Cu2+的綜合評價 為避免單一指標的片面性并克服多個指標的復雜性，全面而準確地評價重金屬離子處理對8種禾本科植物種子萌發(fā)及幼苗生長的影響，采用模糊數學隸屬函數法，對供試8種禾本科植物種子相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽指數、相對活力指數、相對芽長、相對根長、相對芽重和相對根重進行隸屬函數值計算，得出種子萌發(fā)期耐Cu2+脅迫的隸屬函數總平均值。隸屬函數平均值越大,綜合性狀越好，結果表明：耐Cu2+的強弱順序為：玉米>高丹草>燕麥>黑麥>無芒雀麥>黑麥草>垂穗披堿草>高羊茅(表3)。

表3 8種禾本科草種子萌發(fā)期Cu2+的耐性隸屬函數值及綜合評價值Table 3 The value of subordinate function and comprehensive evaluation of the growth indexes of 8 grasses under Cu2+stress during seed germination period

2.2 Cd2+對8種禾本科草種子發(fā)芽和幼苗生長的影響

隨著Cd2+濃度的增大，供試8種植物種子相對發(fā)芽率、發(fā)芽指數和活力指數，幼苗的相對芽長、相對根長、相對芽重和相對根重均呈不同程度的降低趨勢(圖2、表4)。

2.2.1Cd2+對8種禾本科草種子發(fā)芽的影響 供試各Cd2+濃度處理對燕麥和高丹草種子的相對發(fā)芽率影響較小，各處理間無顯著差異，2種草種子的平均相對發(fā)芽率為101%。而垂穗披堿草、無芒雀麥、黑麥草和高羊茅的相對發(fā)芽率隨Cd2+濃度的增大呈降低趨勢，低濃度處理促進了種子的發(fā)芽(圖2A)。供試各Cd2+濃度處理下的8種禾本科草種子的相對發(fā)芽指數和相對發(fā)芽率有相同的趨勢，但200 mg·L-1Cd2+濃度下玉米和高丹草的相對發(fā)芽指數卻顯著高于其他濃度處理(圖2B)。隨著Cd2+濃度的增大，供試8種材料的相對活力指數均呈降低趨勢，低濃度處理(1 mg·L-1、50 mg·L-1Cd2+)對8種牧草種子的活力指數影響較小(圖2C)。在200 mg·L-1Cd2+濃度下，高羊茅不發(fā)芽。

2.2.2Cd2+對8種禾本科草種子幼苗生長的影響 玉米、燕麥、高丹草和垂穗披堿草的相對芽長在供試Cd2+濃度間的差異不顯著；1、50 mg·L-1黑麥草、無芒雀麥、黑麥和高羊茅的相對芽長顯著高于150、200 mg·L-1處理(P<0.05)(表4)。玉米、燕麥、垂穗披堿草、無芒雀麥和高丹草幼苗的相對芽重在1、50 mg·L-1的Cd2+濃度處理間無顯著性差異，但均顯著高于150、200 mg·L-1處理(P<0.05)。150、200 mg·L-1下玉米、燕麥、高丹草、和黑麥間的相對芽長和相對芽重均顯著高于黑麥草、高羊茅(表4)。黑麥草和高丹草幼苗相對根長在1、50 mg·L-1的Cd2+濃度處理下無顯著性差異；燕麥和黑麥的幼苗根長1、50和150 mg·L-1的Cd2+濃度處理下無顯著性差異，但顯著高于200 mg·L-1處理(P<0.05)；1 mg·L-1Cd2+下，玉米、黑麥草、高丹草、垂穗披堿草和黑麥的相對根長顯著高于燕麥、無芒雀麥和高羊茅(P<0.05)(表4)。玉米、燕麥、垂穗披堿草和無芒雀麥幼苗根重在各Cd2+濃度處理間均無顯著性差異。1 mg·L-1的Cd2+處理下，8草種之間的相對根重差異不顯著。50、150 mg·L-1Cd2+下，燕麥、高丹草和黑麥的相對根長顯著高于玉米、黑麥草、垂穗披堿草、無芒雀麥和高羊茅(P<0.05)。150、200 mg·L-1的Cd2+處理下，玉米、燕麥、高丹草和黑麥相對根重顯著高于垂穗披堿草和無芒雀麥(P<0.05)。150、200 mg·L-1處理下，黑麥草和高羊茅出現無根苗。

圖2 不同濃度Cd2+對8種禾本科草種子相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽指數和相對活力指數的影響Fig.2 Effects of different Cd2+concentration on the seed relative germination rate, relative germination index and relative vigor index of 8 grasses

2.2.38種禾本科草種子萌發(fā)期耐Cd2+的綜合評價 采用模糊數學隸屬函數法，對供試8種植物種子相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽指數、相對活力指數、相對芽長、相對根長、相對芽重和相對根重進行隸屬函數值計算，根據隸屬函數總平均值得出種子萌發(fā)期耐Cd2+脅迫的強弱順序為：高丹草>黑麥>玉米>燕麥>無芒雀麥>垂穗披堿草>黑麥草>高羊茅(表5)。

2.3 不同濃度Pb2+對8種禾本科草種子發(fā)芽和幼苗生長的影響

隨著Pb2+濃度的增大，供試8種植物種子相對發(fā)芽率、發(fā)芽指數和活力指數，幼苗的相對芽長、相對根長、相對芽重和相對根重均呈不同程度的降低趨勢(圖3、表6)。

2.3.1Pb2+對8種禾本科草種子發(fā)芽的影響 各Pb2+濃度處理間，玉米和高丹草種子的相對發(fā)芽率均在100%以上，說明Pb2+處理對其種子的發(fā)芽有促進作用，而黑麥和燕麥種子的相對發(fā)芽率在90%～100%之間，各處理間無顯著的差異，垂穗披堿草、無芒雀麥、黑麥草和高羊茅種子的相對發(fā)芽率隨Pb2+濃度的增大呈降低趨勢(圖3A)。各Pb2+濃度處理下，8種禾草種子的相對發(fā)芽指數和相對發(fā)芽率有相同的趨勢，500 mg·L-1Pb2+濃度處理下，垂穗披堿草和黑麥草的相對發(fā)芽指數均高于0.8，顯著高于其他處理下的相對發(fā)芽指數(圖3B)。和其他兩種金屬離子處理一樣，隨著Pb2+濃度增大，黑麥草和高羊茅的相對活力指數呈降低趨勢，高濃度處理下的活力指數顯著低于低濃度處理(圖3C)。

表4 不同濃度Cd2+對8種禾本科草種子相對芽長、相對根長、相對芽重和相對根重的影響Table 4 Effects of different Cd2+ concentration on the seed relative bud length, relative root length,relative shoot weight and relative root of 8 grasses

表5 8種禾本科草種子萌發(fā)期Cd2+的耐性隸屬函數值及綜合評價值Table 5 The value of subordinate function and comprehensive evaluation of the growth indexes of 8 grasses under Cd2+stress during seed germination period

圖3 不同濃度Pb2+對8種禾本科草種子相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽指數和相對活力指數的影響Fig.3 Effects of different Pb2+ concentration on the seed relative germination rate, relative germination index and relative vigor index of 8 grasses

2.3.2Pb2+對8種禾本科草種子幼苗生長的影響 供試各Pb2+濃度下，燕麥的相對芽長均無顯著差異(表6)。500 mg·L-1的Pb2+處理下玉米、垂穗披堿草、無芒雀麥、黑麥草和高羊茅的相對芽長顯著高于1 000、1 500和2 000 mg·L-1處理(P<0.05)。500、1 000 mg·L-1的Pb2+處理下，燕麥、高丹草和無芒雀麥的相對芽長顯著高于玉米、黑麥、黑麥草、垂穗披堿草和高羊茅(P<0.05)(表6)。黑麥草、燕麥和高丹草的相對芽重，在各供試Pb2+濃度間的差異不顯著(表6)。500、1 000和1 500 mg·L-1的Pb2+處理下玉米、無芒雀麥和黑麥的相對芽重顯著高于2 000 mg·L-1處理(P<0.05)。500 mg·L-1的Pb2+處理下黑麥草、高丹草和黑麥的相對芽重顯著高于玉米、燕麥、垂穗披堿草和無芒雀麥(表6)。供試各Pb2+濃度下，玉米、燕麥和黑麥的相對根長和相對根重顯著高于垂穗披堿草、黑麥草和高羊茅(P<0.05)((表6)。500 mg·L-1的Pb2+處理下垂穗披堿草、無芒雀麥、黑麥草、燕麥和玉米的相對根長顯著高于1 000 mg·L-1處理，且顯著高于1 500、2 000 mg·L-1處理(P<0.05)。Pb2+濃度處理對黑麥草和高羊茅的幼苗生長抑制作用較強。

表6 不同濃度Pb2+對8種禾本科草種子相對芽長、相對根長、相對芽重和相對根重的影響Table 6 Effects of different Pb2+ concentration on the seed relative bud length, relative root length, relative shoot weight and relative root of 8 grasses

2.3.38種禾本科草種子萌發(fā)期耐Pb2+的綜合評價 采用模糊數學隸屬函數法，對供試8種禾本科植物種子的7種指標進行隸屬函數值計算，根據隸屬函數總平均值得出種子萌發(fā)期耐Pb2+脅迫的強弱順序為：高丹草>燕麥>玉米>黑麥>無芒雀麥>垂穗披堿草>黑麥草>高羊茅(表7)。

表7 8種禾本科草種子萌發(fā)期Pb2+的耐性隸屬函數值及綜合評價值Table 7 The value of subordinate function and comprehensive evaluation of the growth indexes of 8 grasses under Pb2+stress during seed germination period

3 討論

重金屬會對種子發(fā)芽和幼苗生長產生不同程度的抑制和刺激，種子的萌發(fā)和早期發(fā)育對污染物的影響尤為敏感。本研究結果表明隨著Cu2+、Cd2+和Pb2+濃度的增大，供試8種禾本科草類植物種子相對發(fā)芽率、發(fā)芽指數和活力指數，均呈不同程度的降低趨勢。總體來看，3種重金屬離子對玉米、燕麥、高丹草和黑麥種子萌發(fā)抑制作用較小，而對垂穗披堿草、無芒雀麥、黑麥草和高羊茅草種發(fā)芽抑制作用較大。這可能與種子對重金屬毒性的響應程度不同有關[21]。在3種不同重金屬離子濃度處理下，對玉米、高丹草和黑麥草種的發(fā)芽表現為低濃度的促進和高濃度的抑制，這與劉明美[22]、張震等[23]研究重金屬對草種子萌發(fā)和幼苗生長的影響存在較低濃度促進效應和高濃度抑制效應的結論相似。此外，也有研究表明Cd2+促進早熟禾、金雞菊、狗牙根和剪股穎的苗生長，而抑制黑麥草、高羊茅、白三葉、非洲鳳仙幼苗的生長[21]。說明不同植物受重金屬影響程度存在差異。本研究中，隨著重金屬Cu2+濃度的增大，對玉米、高丹草和燕麥的相對芽長和相對芽重有促進作用，其他5種禾本科草類植物幼苗的芽長和芽重均呈不同程度的下降趨勢。高柱等[24]研究表明重金屬Cu2+脅迫濃度較低時，對蘇丹草發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數的影響為促進作用，這與我們的研究結論相似。而供試8種禾本科草種的相對根長和相對根重均呈下降趨勢。因為根是植物吸收水分的器官，在其生長和發(fā)育中，一直完全與重金屬溶液接觸，故受到重金屬的影響最為嚴重[25-26]。隨著重金屬Cd2+和Pb2+濃度的增大，除了個別由于種子取材不均而導致的較小差異以外，供試8種禾本科草種的幼苗生長均呈下降趨勢；8種禾本科草類植物間相比，高丹草和黑麥幼苗長度下降的相對較慢，其它6種下降的較快，這說明高丹草和黑麥幼苗的生長對Cd2+和Pb2+耐性優(yōu)于其他6種供試禾本科草類植物種子。本研究結果表明，Cu2+、Cd2+和Pb2+對植物幼苗生長均有抑制作用，高濃度脅迫下就出現“無根苗”，尤其是黑麥草和高羊茅。重金屬脅迫下植物根系比莖葉響應更為強烈，這與王彥梅等[27]研究重金屬對小麥和黑麥生長的脅迫結果相一致。

4 結論

本研究采用性狀相對值進行隸屬函數值綜合評價，研究了重金屬Cu2+、Cd2+和Pb2+對8種禾草種子萌發(fā)和幼苗生長的影響。結果表明，種子萌發(fā)期耐Cu2+的強弱順序為：玉米>高丹草>燕麥>黑麥>無芒雀麥>黑麥草>垂穗披堿草>高羊茅，耐Cd2+的強弱順序為：高丹草>黑麥>玉米>燕麥>無芒雀麥>垂穗披堿草>黑麥草>高羊茅，耐Pb2+的強弱順序為：高丹草>燕麥>玉米>黑麥>無芒雀麥>垂穗披堿草>黑麥草>高羊茅。綜合而言，玉米、高丹草、黑麥和燕麥在萌發(fā)期對Cu2+、Cd2+、Pb2+脅迫的耐受力較強。