李 ，

(齊齊哈爾大學生命科學與農(nóng)林學院， 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室， 黑龍江 齊齊哈爾161006)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是最有價值的栽培牧草之一，世界各地廣泛種植，根系發(fā)達，主根粗大，抗逆境和可再生能力較為強大，產(chǎn)草量高，富含蛋白質，適口性好，固氮能力強，是我國人工種植面積最大的豆科牧草[1-2]，在我國生態(tài)環(huán)境建設、生態(tài)修復方面起著重要的作用[3]。

60Co-γ射線輻照是最為有效的人工誘變育種方法之一，目前國內外關于牧草的γ射線輻射誘變育種工作廣泛展開, 主要集中對牧草品種對射線的輻照敏感性、育種的適宜劑量及其輻射誘變規(guī)律的研究[4-6]。植物體的形態(tài)結構和生理功能是統(tǒng)一的，功能的差異必然與相應的器官結構緊密相關[7]。利用60Co-γ射線輻照研究其對植物顯微結構的影響的研究甚少，如李黎等利用60Co-γ輻射對兩個不同品種菊花的葉片組織結構的影響進行研究，通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，輻射后植株葉片的柵欄組織的排列比對照植株排列疏松，柵欄組織細胞層數(shù)增多[8]。本文研究了60Co-γ輻射苜蓿根莖葉等營養(yǎng)器官的生理結構的影響，以期為利用60Co-γ射線輻照選育苜蓿新品種提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為黑龍江省畜牧研究所提供的‘龍牧806’苜蓿干種子，其具有耐寒、耐鹽堿，高產(chǎn)等特性，適合在低溫及鹽堿地上栽種。

1.2 研究方法

1.2.160Co-γ射線輻射處理60Co-γ輻射源由中國農(nóng)業(yè)科學研究院原子能利用研究所提供，輻射劑量依次為600，900，1 200，1 500 和1 800 Gy共5個劑量，劑量率15 Gy·min-1，每份處理50 g種子，以同一批次相同數(shù)量未經(jīng)處理的種子作為對照(CK)。

1.2.2幼苗的培養(yǎng) 取5種劑量的60Co-γ(600，900，1 200，1 500和1 800 Gy)射線輻射處理和未輻射的苜蓿種子，采用土培的方法將其種植在營養(yǎng)缽中(針葉土、營養(yǎng)土和珍珠巖按1∶2∶0.5比例進行混合)，1 800 Gy輻射劑量的苜蓿種子雖然能出苗，但在培養(yǎng)期間逐漸死亡，其它輻射劑量和對照的苜蓿幼苗待生長至三葉一心期后備用。

1.2.3顯微結構樣品的制備與觀測 45 d后分別剪取各處理植株根、莖、葉材料，根部為成熟區(qū)的相同部位，莖采集第3葉位的莖段，葉片取第3葉位三出復葉中間小葉的中部[7]，葉片中部葉脈為中心橫切成大小為5 mm×7 mm的小塊，根、莖切成1 cm長的小段。立即用福爾馬林-乙酸-乙醇固定液(FAA)固定，1%番紅水溶液染色2 h，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片厚度為8～12 μm，用0.5%固綠復染，中性膠封片，于Motic-MODEL-BA300LE顯微鏡下觀察和攝影，每個處理樣本隨機取10個視野求平均值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

柵海比=柵欄組織厚度/海綿組織厚度

葉片柵欄組織結構緊密度(CTR)=(柵欄組織厚度/葉片厚度)×100%

葉片海綿組織結構疏松度(SR)=(海綿組織厚度/葉片厚度)×100%

利用Excel 2010對數(shù)據(jù)進行整理，采用SPSS 17.0中單因素方差分析(one-way ANOVA)對植物組織結構特征指標進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 60Co-γ射線輻射對苜蓿根顯微結構的影響

苜蓿根的顯微結構包括表皮、皮層、維管柱組成(圖1)。在不同劑量的60Co-γ輻射處理下，苜蓿根的直徑、皮層薄壁細胞的厚度、表皮的厚度、維管柱的直徑、原生導管及后生導管的直徑均會產(chǎn)生不同程度的影響。當輻射劑量為1 500 Gy時，苜蓿根的厚度、皮層薄壁細胞的厚度、表皮的厚度，維管柱的直徑、原生導管及后生導管的直徑均達到最大值。

不同輻射劑量處理下苜蓿根的表皮和皮層厚度、根、導管和維管柱直徑均隨著輻射劑量的增加呈現(xiàn)上升變化趨勢(表1)，當輻射劑量為600和1 500 Gy時，根表皮的厚度比對照組增加了34.32%和111.9%，根皮層厚度比對照組增加了12.27%和39.39%，根直徑比對照組增加了36.05%和209.87%，根原生導管的直徑比對照組增加了14.03%和137.19%，后生導管的直徑比對照組增加了39.29%和129.44%，根維管柱直徑比對照組增加了41.00%和251.29%。低劑量與高劑量之間苜蓿根的表皮厚度、皮層厚度、根直徑、原生導管直徑、后生導管直徑和維管柱直徑均差異顯著(P<0.05)。輻射對根的維管柱直徑和根厚度影響最大，其次為原生導管直徑、后生導管直徑和表皮厚度，對皮層厚度影響最小。

表1 60Co-γ處理下苜蓿種子的幼苗根顯微結構的特征Table 1 Root structure characteristics of the seedlings of 60Co-γ radiation alfalfa seeds

注：同列不同小寫字母表示差異顯著, 下同

Note: Different small letters in the same row indicate significant difference at the 0.05 level. The same as below

圖1 60Co-γ射線輻射苜蓿種子的幼苗根解剖結構Fig.1 Roots anatomical structure of the seedlings of 60Co-γ radiation alfalfa seeds注：圖中1，2，3，4和5依次為輻射劑量0,600,900,1 200和1 500 Gy時根的顯微結構(×40)；6，7，8，9和10依次為輻射劑量0,600,900,1 200和1 500 Gy時根的顯微結構(×400)Note: The 1, 2, 3, 4 and 5 micrographs of the root were in the order of radiation dose of 0, 600, 900, 1 200 and 1 500 Gy (×40), and the 6, 7, 8, 9 and 10 micrographs of the root were in the order of radiation dose of 0, 600, 900, 1 200 and 1 500 Gy (×400)

2.2 60Co-γ射線輻射對苜蓿莖顯微結構的影響

莖的顯微結構由表皮、皮層、維管束和髓組成(圖2)。在不同劑量的60Co-γ射線輻射處理下，苜蓿莖的表皮和皮層薄壁厚度、維管束和髓直徑均會產(chǎn)生不同程度的影響。當輻射劑量達1 500 Gy時，苜蓿莖的表皮厚度、皮層薄壁厚度、維管束直徑、髓直徑均達到最大值。

經(jīng)過不同輻射劑量處理后，苜蓿莖的表皮和皮層薄壁細胞厚度及維管束直徑和髓直徑均產(chǎn)生不同程度的變化(表2)。當輻射劑量為600和1 500 Gy時，其莖的表皮厚度與對照組比較增加了23.23%和59.01%，皮層薄壁細胞厚度與對照比較增加了1.74%和24.48%，維管束直徑與對照比較增加了9.95%和52.72%，髓的直徑與對照比較增加了20.42%和69.07%。除600和900 Gy輻射劑量外的皮層薄壁細胞厚度外，其它輻射劑量的苜蓿莖的表皮厚度、皮層薄壁厚度、維管束直徑、髓直徑與對照比較均差異顯著(P<0.05)，特別是高輻射劑量對苜蓿莖的顯微結構的影響更大。輻射對莖的表皮厚度、維管束直徑和髓的直徑影響比較大，對皮層薄壁細胞厚度影響最小。

2.3 60Co-γ射線輻射對苜蓿葉片顯微結構的影響

葉的顯微結構由上下表皮、葉肉和葉脈組成(圖3)。在不同劑量的60Co-γ射線輻射處理下，苜蓿葉片的上表皮、下表皮、葉片、柵欄組織、海綿組織脈凸起厚度均會產(chǎn)生不同程度的影響。當輻射劑量達1 500 Gy時，苜蓿葉片的上表皮厚度、下表皮厚度、葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度和葉脈凸起厚度均達到最大值。

經(jīng)不同輻射劑量處理后，苜蓿葉片的上表皮厚度、下表皮厚度、葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度和葉脈凸起厚度均產(chǎn)生不同程度的變化(表3)。當輻射劑量為600和1 500 Gy時，其葉片厚度分別比對照組增加了6.43%和30.86%，上表皮厚度分別比對照組增加了3.95%和47.29%，下表皮厚度分別比對照組增加了4.39%和37.78%，葉脈凸起的厚度分別比對照組增加了4.09%和16.60%，柵欄組織厚度分別比對照組增加了8.06%和23.64%，海綿組織厚度分別比對照組增加了6.45%和26.96%。各輻射組與對照組間比較，在葉片的厚度、上下表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度和葉脈凸起厚度均差異性顯著(P<0.05)，輻射組之間比較，低劑量與高劑量輻射組間差異顯著(P<0.05)，說明60Co-γ射線輻射對苜蓿葉片的結構產(chǎn)生了一定的影響，特別是高劑量輻射對葉片結構影響極大。

表2 60Co-γ處理下苜蓿種子的幼苗莖顯微結構的特征Table 2 Stem structure characteristics of the seedlings of 60Co-γ radiation alfalfa seeds

圖2 60Co-γ射線輻射苜蓿種子的幼苗莖解剖結構Fig.2 Stems anatomical structure of the seedlings of 60Co-γ radiation alfalfa seeds注：1，2，3，4和5為輻射劑量為0，600，900，1 200和1 500 Gy時莖的顯微結構(×40)， 6，7，8，9和10為輻射劑量為0，600，900，1 200和1 500 Gy時莖的顯微結構(×400)Note: The 1, 2, 3, 4 and 5 micrographs of stems were in order of rsdiation dose of 0,600,900,1 200,1 500 Gy(×40),and the 6,7,8,9 and 10 micrographs of the stems were in order of radiation dose of 0,600,900,1 200 and 1 500 Gy(×400)

表3 不同劑量60Co-γ處理下苜蓿種子的幼苗葉片結構特征Table 3 Leaf structure characteristics of the seedlings of 60Co-γ radiation alfalfa seeds

圖3 60Co-γ射線輻射苜蓿種子的幼苗葉片解剖結構Fig.3 Leaves anatomical structure of the seedlings of 60Co-γ radiation alfalfa seeds注：1，2，3，4和5分別為對照和輻射劑量為0，600，900，1 200和1 500 Gy時葉片的顯微結構(×40)， 6，7，8，9和10分別為對照和輻射劑量為0，600，900，1 200和1 500 Gy時葉片的顯微結構(×400)Note: The 1, 2, 3, 4 and 5 micrographs of the leaves were in the ovder of radiation dose of 0,600,900,1 200 and 1 500 Gy(×40),and 6,7,8,9 and 10 microraphs of the leaves were in the order of radiation dose of 0,600,900,1 200 and 1 500 Gy(×400)

苜蓿葉片有明顯的柵欄組織和海綿組織分化，其中葉片柵海比值、柵欄組織緊密程度和海綿組織的疏松程度見表4。不同輻射苜蓿葉片柵海比值均大于1，柵欄組織的厚度大于海綿組織的厚度。當輻射劑量為600，900，1 200，1 500 Gy時苜蓿葉片的柵海比、柵欄組織結構緊密度和海綿組織結構疏松程度均產(chǎn)生不同程度的影響。除輻射劑量為600 Gy時其柵海比與對照組比較增加時，其他輻射劑量的柵海比、柵欄組織結構緊密度和海綿組織結構疏松程度均有減小的變化趨勢。輻射劑量為1 500 Gy時柵海比、柵欄組織緊實密度和海綿組織的疏松度分別比對照組減小了2.67%，25.00%和26.67%。60Co-γ射線輻射對苜蓿葉片的柵海比沒有顯著影響，但對柵欄組織的緊實密度、海綿組織的疏松度產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)，各輻射組之間無顯著差異。輻射對葉片的上表皮厚度、葉片的厚度、下表皮厚度和柵欄組織厚度影響大，海綿組織的厚度、柵海比值、柵欄組織緊實密度和海綿組織疏松度影響比較大，葉脈凸起厚度影響最小。

表4 葉片顯微結構參數(shù)測定結果Table 4 Determination results of leaf microstructure parameters

3 討論與結論

根是植物吸收水分和營養(yǎng)物質最重要的器官，也是最先感受土壤逆境脅迫最重要的部位，莖是將根吸收的水、無機鹽、以及葉制造的的有機物進行輸導，在植物生長發(fā)育的過程中經(jīng)常會遇到干旱、鹽堿等不良環(huán)境條件的影響[8],植物會逐漸演化出各種各樣形態(tài)結構以適應逆境。

本研究中根莖葉的顯微結構對60Co-γ射線的輻射劑量變化的反應敏感，隨著輻射劑量的增加，苜蓿根部的表皮厚度，皮層厚度維管柱直徑、原生導管和后生導管的直徑均有增加的趨勢，這與植物對環(huán)境脅迫的響應有相似之處。如朱宇旌等[9]發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫等逆境條件下，植物可以增加表皮、皮層薄壁細胞的厚度來抑制鹽脅迫等滲透脅迫對植物根系的危害。本研究中，隨著輻射劑量增加莖的表皮厚度、皮層薄壁厚度、維管束直徑、髓直徑也均有增加的變化趨勢，劉海學等研究[10]NaCl脅迫對向日葵幼苗生長及莖組織解剖結構的影響，發(fā)現(xiàn)莖的解剖結構隨著鹽脅迫強度的增加而變化，薄壁細胞和皮層細胞層數(shù)明顯增多，皮層厚角組織層數(shù)也均有增加，這與本研究的結果一致。此外，隨著輻射劑量增加葉片厚度、上下表皮厚度、葉脈凸起厚度、海綿組織和柵欄組織厚度均有增加的趨勢, 柵海比有減少的變化趨勢，這與寇建村等[11]研究不同紫花苜蓿品種葉片的旱生結構和郭鵬等[12]對鹽堿脅迫下紫花苜蓿的生理學及解剖學特征的研究結果基本一致。根莖葉的顯微結構可隨著環(huán)境的變化而變化，其結構特征最能體現(xiàn)環(huán)境因子與植物的協(xié)同進化。通過輻射使苜蓿根和莖的輸導能力增加，葉片的光合效率增強，這可能是植物可抵御外界輻射影響的一個重要原因。

綜上所述，60Co-γ射線輻射能夠顯著影響紫花苜蓿幼苗的根莖葉顯微結構，不同劑量的60Co-γ射線輻射下苜蓿幼苗根、莖、葉顯微結構差異顯著，當輻射劑量為1 500 Gy時，與其它輻射劑量組別相比，所測各組織結構指數(shù)均達到最大值。而輻射劑量為1 800 Gy時，苜蓿干種子出苗后真葉未能長出，導致該輻射劑量下苜蓿無成苗，此輻射劑量可視為苜蓿種子60Co-γ射線輻射的致死劑量。