馬玉姍 刁敏 林雪梅 屈藝 李浩 柳慧

( 四川大學華西第二醫(yī)院 1.麻醉科；2. 出生缺陷與相關婦兒疾病教育部重點實驗室，四川 成都 610041；3. 四川大學華西醫(yī)院麻醉科，四川 成都 610041)

促紅細胞生成素(Erythropoietin, EPO)是一種多效性細胞因子，其主要活性是通過抑制骨髓中紅系祖細胞的凋亡而達到促進紅細胞生成的作用[1]。利用重組DNA技術人工合成的重組人促紅細胞生成素(Recombiant Human Erythropoietin, rhEPO)已廣泛用于臨床治療包括癌癥[2]、早產[3]及慢性腎病[4]等多種原因引起的貧血。EPO除了具有造血活性外，還具有廣泛的組織保護活性，尤其是對神經系統(tǒng)的保護作用引起了學者們的廣泛關注。我們在前期研究中發(fā)現，在胎鼠宮內缺氧缺血模型中，EPO能夠很好地通過胎盤和血腦屏障，對胎鼠宮內缺氧缺血性腦損傷產生保護作用[5-6]。然而EPO發(fā)揮組織保護作用的劑量(1000U/Kg )遠遠大于促進紅細胞生成的劑量(50-100U/Kg )[7-9]。大劑量或長期使用EPO可造成對骨髓造血系統(tǒng)的過度刺激，從而導致紅細胞增多癥、高血壓及血栓形成等不良反應[10]。尤其是妊娠期婦女血液處于高凝狀態(tài)[11]，EPO的使用不可避免地會導致圍產期發(fā)生血栓性疾病的風險增加，這就限制了EPO在產科的進一步應用。

氨甲酰化促紅細胞生成素 (Carbamylated Erythropoietin, CEPO) 是EPO的衍生物。在EPO中加入氰酸鹽，將EPO中的賴氨酸殘基變成高瓜氨酸殘基，使其喪失促進紅細胞生成的作用[10]，卻保留了組織保護作用。CEPO功能上的優(yōu)勢使其在組織保護方面具有取代EPO的趨勢，并已進入二期臨床研究階段[12]。目前有關EPO作用于孕鼠的研究較少，罕見關于EPO或CEPO對孕鼠血液流變學影響的相關報道。本研究擬通過孕鼠腹腔給予大劑量EPO和CEPO，觀察孕鼠紅細胞生成及血液粘滯度相關指標的變化，明確EPO和CEPO對孕鼠血液流變學的影響，為將來應用于產科臨床提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 設備與材料 EPO(成都地奧集團)，氰酸鉀(Sigma 公司)，硼酸鈉(成都市科龍化工試劑廠)，戊巴比妥鈉，醫(yī)用石蠟、中性樹膠(上海懿洋)，伊紅(Merck)，蘇木精(Amresco)，TO透明劑(上海源葉)，超濾管(Millipore)，透析袋(Viskase)，真空采血管(美國 BD)，靜脈留置針(泰爾茂日本)，XE-2100全自動血液分析儀，SA-6000全自動血液流變儀(北京賽科希德)

1.2 實驗動物 育齡期無交配史SD大鼠購至成都達碩動物有限公司, 體重240～260g。孕鼠以繁殖顆粒飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為室溫22℃，相對濕度85 %。

1.3 CEPO制備 根據Leist等[13]的方法制備CEPO。0.5mg(1mg/ml) EPO 與0.5ml 1mol/L 硼酸鈉(PH 8.8)和81.11mg氰酸鉀(KOCN 分子量81.11)混勻, 使KOCN最終濃度為1mol/L, 放入37℃恒溫水浴儀，溫浴23h后移至透析袋中, 夾緊袋口, 在1000ml Milli-Q water中4℃透析過夜。再放入1000ml 20 mmol/L 檸檬酸鈉0.1 mol/L NaCl (PH 6.0)中4℃透析過夜。再置于0.02mol/L檸檬酸鈉1000ml及0.1mol/L NaCl(pH6.0)中4℃過夜。獲得的CEPO采用考馬斯亮藍G250法測定濃度。

1.4 確定妊娠 將發(fā)情期且既往無交配史的雌、雄SD大鼠按2:1比例合籠。從次日晨起用棉簽作陰道涂片，在顯微鏡下查看分泌物中是否含有精子, 并檢查籠中是否有陰道栓。如發(fā)現有其中一項即初步判斷為受孕，并將當日定為受孕第1天, 提出單籠飼養(yǎng)至孕17天。記錄每日體重增加情況，并作為是否懷孕的另一依據。如期間體重不隨受孕天數增長，則排除受孕。

1.5 實驗分組及方法 將15只孕17天SD大鼠隨機分為生理鹽水對照組(NS組)、EPO處理組( EPO組)及CEPO處理組(CEPO組)，每組5只。各組分別經腹腔注射0.9%NS (1mL/次)、EPO(5000 U /Kg)及CEPO(50 μg/Kg)，連續(xù)3天。其中，EPO及CEPO用0.9% NS稀釋至1ml。給藥未滿4天的孕鼠如發(fā)生自然分娩，則不納入實驗。

1.6 檢測指標 連續(xù)給藥3天，于第4天將孕鼠用1%戊巴比妥鈉(40mg/kg腹腔內注射)麻醉后經下腔靜脈采血，檢測紅細胞生成相關指標：網織紅細胞計數(Reticulocyte Count, RET#)、網織紅細胞百分比(RET%)、紅細胞計數(Red Blood Cell, RBC)及血紅蛋白(Hemoglobin, HGB)等，以及血液流變學相關指標：低切變率1全血粘度、低切變率5全血粘度、中切變率50全血粘度及高切變率200全血粘度、紅細胞聚集指數(Erythrocyte Aggregation Index, EAI)及紅細胞壓積(Hematocrit, HCT)。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量數據以均數±標準誤(Mean±SEM)表示，多組間比較使用單因素方差分析(ANOVA)，若方差齊性，則兩兩比較使用LSD法；若方差不齊，則兩兩比較使用Dunnett's T3法。采用Pearson相關分析對計量數據進行相關性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 紅細胞生成相關指標的比較

2.1.1 EPO導致孕鼠網織紅細胞絕對值及百分比(RET#及RET%)升高，且主要引起幼稚RET比例的增加，提示EPO能刺激孕鼠骨髓的造血功能 EPO組的RET#及RET %均高于NS組及CEPO組(P<0.05)，NS組及CEPO組組間比較無差異(P>0.05)，見圖1～2。

圖1 CEPO (50 μg/Kg) 及EPO (5,000 U/Kg) 對 RET#的影響

Figure1EffectsofCEPO(50μg/Kg)andEPO(5000U/Kg)onRET#

注：與NS組，①P<0.05；與EPO組，②P<0.05

圖2 CEPO (50 μg/Kg) 及EPO (5000 U/Kg) 對RET%的影響

Figure2EffectsofCEPO(50μg/Kg)andEPO(5000U/Kg)onRET%

注：與NS組，①P<0.05；與EPO組，②P<0.05

本研究的結果顯示：MFR%各組間比較無明顯差異(P>0.05)；EPO組的IRF及HFR%均高于NS組及CEPO組(P<0.05)，而LFR%低于NS組及CEPO組(P<0.05)；CEPO組的IRF、LFR%、MFR%及HFR%與NS組比較均無明顯差異(P>0.05)，見圖3。以上結果提示EPO 組幼稚RET增加，骨髓造血功能活躍。

圖3 CEPO (50 μg/Kg)及EPO (5000 U/Kg) 對RET分類的影響

Figure3EffectsofCEPO(50μg/Kg)andEPO(5000U/Kg)onRETclassification

注：與NS組，①P<0.05；與EPO組，②P<0.05

2.1.2 EPO導致孕鼠紅細胞計數(RBC)及血紅蛋白(HGB)升高 EPO組的RBC及HGB均高于NS組及CEPO組(P<0.05)，NS組及CEPO組組間比較無明顯差異(P>0.05)，見圖4、5。提示EPO組外周血中紅細胞生成增加。

2.2 血液流變學相關指標比較顯示：EPO導致全血粘滯度升高的風險增加

2.2.1 EPO導致孕鼠全血粘滯度增加 低切變率全血粘度能反映紅細胞的聚集性。低切變率全血粘度越高，紅細胞聚集性越高。EPO 組低切變率1(1/s)全血粘度、低切變率5(1/s)全血粘度及中切變率50(1/s)全血粘度均高于NS組及CEPO 組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)； NS組與CEPO 組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；各組間高切變率200(1/s)全血粘度比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖6。EPO組的紅細胞聚集指數(EAI)高于NS組和CEPO組，但各組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖7。

圖4 CEPO (50 μg/Kg) 及EPO (5000 U/Kg) 對 RBC的影響

Figure4EffectsofCEPO(50μg/Kg)andEPO(5,000U/Kg)onRBC

注：與NS組，①P<0.05；與EPO組，②P<0.05

圖5 CEPO (50 μg/Kg) 及EPO (5000 U/Kg) 對HGB的影響

Figure5EffectsofCEPO(50μg/Kg)andEPO(5000U/Kg)onHGB

注：與NS組，①P<0.05；與EPO組，②P<0.05

圖6 CEPO (50 μg/Kg) 及EPO (5000 U/Kg) 對全血粘度的影響

Figure6EffectsofCEPO(50μg/Kg)andEPO(5000U/Kg)onbloodviscosity

注：與NS組，①P<0.05；與EPO組，②P<0.05

2.2.2 EPO導致紅細胞壓積(HCT)的增加 HCT是反映血液濃度的指標，在影響血液粘度的諸因素中，HCT對不同切變率下的全血粘度影響最大。EPO組的HCT高于NS組及CEPO組(P<0.05)，其余各組間比較無差異(P>0.05)，見圖8。

圖7 CEPO (50 μg/Kg) 及EPO (5000 U/Kg) 對EAI的影響

Figure7EffectsofCEPO(50μg/Kg)andEPO(5000U/Kg)onErythrocyteAggregationIndex

圖8 CEPO (50 μg/Kg)及EPO (5000 U/Kg) 對 HCT的影響Figure 8 Effects of CEPO (50 μg/Kg) and EPO (5000 U/Kg) on HCT注：與NS組，①P<0.05；與EPO組，②P<0.05

2.3 部分檢測指標間相關性分析 紅細胞壓積(HCT)與RBC、HGB、RET # 呈正相關關系，即RBC、HGB、RET # 數值越多，HCT越高。切變率1(1/s)、5(1/s)全血粘度與紅細胞聚集指數(EAI)成正相關，即切變率1(1/s)、5(1/s)全血粘度越高，EAI越高，見表1。

表1 參數相關分析Table1 Analysis of correlations among some parameters

3 討論

網織紅細胞根據RNA含量的多少分為低熒光網織紅細胞(Low Fluorescence Reticulocyte, LFR，成熟網織紅細胞)、中熒光網織紅細胞(Middle Fluorescence Reticulocyte, MFR，中間網織紅細胞)和高熒光網織紅細胞(High Fluorescence Reticulocyte, HFR，未成熟網織紅細胞)。熒光強度越高，提示網織紅細胞含RNA越多，細胞也就越幼稚；反之，熒光強度越低，表示網織紅細胞含RNA越少，細胞也就越成熟。因此，MFR和HFR比RET更早反映紅細胞生成的開始。未成熟網織紅細胞指數(Immature Reticulocyte Fraction, IRF )為MFR%與HFR%之和，反應了幼稚RET占總RET的百分比[14]，能更早、更靈敏地反應骨髓造血功能的開始，是評價抗貧血藥物療效的敏感指標。

造血功能增加時，網織紅細胞發(fā)生變化的順序為MFR、HFR、IRF及RET#[15]，其中HFR的增加反應了紅細胞生成的開始，HFR對EPO功能而言比RET#更實用[16]。本研究說明EPO會刺激骨髓造血功能，使大量不成熟RET從骨髓釋放到外周血中，導致HFR、IRF及RET的增高。有研究報道，給與小鼠連續(xù)3天皮下注射EPO后48小時會導致RBC增加，和我們的結果相似[17]。 多項研究表明HCT、RBC及HGB的增加是導致血栓發(fā)生的危險因素[18-21]。主要原因可能是紅細胞增加與凝血功能的增加有關：血紅蛋白過低的患者出血風險增加，但進行輸血治療后能糾正出血；血小板減少的病人即使不輸血小板，只輸入紅細胞也會改善其凝血功能[22]。而凝血功能是血栓形成的三要素之一，凝血功能的增加會使血栓形成的風險增加。除了凝血功能改變外，血流改變是血栓形成的三要素中的另一重要因素。血液流變學的異?？赡軐е卵赫硿仍黾?，血流緩慢，血管阻力增加，血流淤滯容易使凝血物質聚集，導致血栓形成，是公認的血栓性疾病的預見性指標。

我們檢測了全血粘度、EAI及HCT等血液流變學指標，發(fā)現給予EPO能導致血液低切變率1(1/s) 全血粘度、低切變率5(1/s) 全血粘度、中切變率50(1/s)全血粘度、EAI及HCT的增加，而CEPO則沒有該作用。全血粘度反映了血液在流動過程中產生的流動摩擦力，主要影響因素有紅細胞壓積(HCT)、紅細胞的流變性(包括紅細胞聚集性和紅細胞變形性)以及切變率，其中低切變率全血粘度主要反映紅細胞聚集性，具有較大的意義。我們的結果顯示紅細胞聚集性增高和低切全血粘度增高呈正相關(r=0.958，P=0.000)，說明低切變率下血流緩慢，血液粘滯度越高，紅細胞越容易聚集。因此紅細胞聚集性增高可能是導致低切變率下血液粘度增高的原因。

我們還發(fā)現注射EPO后會導致孕鼠HCT增加，而CEPO則沒有該作用。在影響血液粘度的多個因素中，HCT對不同切變率下的全血粘度影響最大[23]。血液粘度隨HCT的增加而增加，當HCT 在25.32%到60.16%之間時，HCT增加10.99%會導致血液粘滯度增加20%，根據泊簫葉公式，粘滯度增加20%會減緩血流16.67%。生理上為了代償20%血液粘滯度增加，血壓會增加20%，或血管半徑會擴張4.66%，當冠心病患者血管擴張受限時，就會導致心肌缺血[24]。因此，EPO的藥品說明書中的不良反應防范中明確指出，用藥過程中需要監(jiān)測HCT，當HCT高于40%，應停用，當下降到36%后，再繼續(xù)給予EPO，以免血栓的發(fā)生。而我們的結果表明，注射CEPO不會導致孕鼠HCT增加，即不會增加孕鼠血液粘滯度，不會增加血栓形成的風險。

4 結論

本研究結果表明，與EPO相比， CEPO不會促進母鼠骨髓造血功能增加、紅細胞生成，不會改變低切全血粘度及HCT等血液流變學指標，不會導致血液粘滯度的增加，具有更好的產科應用前景。