唐漢慶,龐路路,張世田,馮 悅,寧晚玲,王露瑤

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西百色 533000；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧 530001)

心血管功能異常使心血管疾病的發(fā)病率和死亡率上升，冠心病(coronary heart disease，CHD)由于冠狀動脈循環(huán)異常引起心肌缺血、心功能受損，嚴(yán)重危害健康，研究顯示[1],血管內(nèi)皮功能紊亂是冠心病發(fā)生的重要因素和中心環(huán)節(jié)，也是CHD冠狀動脈痙攣以及心絞痛發(fā)生的重要原因。由于高血壓、CHD、炎癥等引起的氧化應(yīng)激損傷產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxy gen species,ROS)，引起心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞受損及功能障礙，促進(jìn)CHD等發(fā)生發(fā)展。因此，減輕氧化應(yīng)激損傷、改善微循環(huán)是早期防治CHD的關(guān)鍵。氧化應(yīng)激伴有血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)激活，通過NADPH氧化酶2(NOX2)促進(jìn)ROS和炎癥介質(zhì)大量產(chǎn)生，ROS和炎癥介質(zhì)的作用引起心肌細(xì)胞氧化損傷和內(nèi)皮細(xì)胞功能異常以及血管改變。機(jī)體內(nèi)部存在氧化和抗氧化機(jī)制，血府逐瘀湯活血化瘀功效確切，本試驗(yàn)通過建立冠心病家兔血瘀模型，給予血府逐瘀湯干預(yù)，檢測與氧化、抗氧化密切相關(guān)的細(xì)胞分子水平及NOX2表達(dá)變化，從抗氧化角度探討血府逐瘀湯對CHD的治療作用環(huán)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級健康家兔48只，雌雄各半，體重2.8 kg±0.8 kg，右江民族醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，動物合格證編號SCXK(桂)2014—0002，常規(guī)喂飼。

1.1.2 主要試劑和儀器 AngⅡ(批號20150223)、ROS(批號20150466)、丙二醛(malonaldehyde,MDA，批號20150822)、超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase,SOD，批號20150615)、谷胱甘肽(glutathione,GSH，批號20160624)、總抗氧化能力(total antioxidative capacity,T-AOC，批號20160610)、肌酸激酶(creatine kinase，CK，批號20150314)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH，批號20150611)試劑盒，均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；NOX2免疫組化試劑盒(批號CQ14112B),美國Sigma公司產(chǎn)品；全自動生化儀(BS-400型)，深圳邁瑞公司產(chǎn)品產(chǎn)品；圖像分析儀(Q550CWX型)，德國萊卡公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀(MK3型)，美國Thermos Labsystem公司產(chǎn)品；小動物呼吸機(jī)(BiPAP Synchrony)，上海飛利浦公司產(chǎn)品；γ放射免疫計(jì)數(shù)器(FJ-2021型)，廣州飛迪公司產(chǎn)品；倒置生物顯微鏡(DMIL LED型)，德國萊卡公司產(chǎn)品；電腦快速恒冷冷凍石蠟兩用切片機(jī)(KD-2258-VI型)，浙江科迪公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動物造模和分組 動物按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組，模型組，假手術(shù)組，血府逐瘀湯低、中、高劑量6組，每組8只。模型組、低劑量、中劑量、高劑量組造模方法參照文獻(xiàn)[2]，動物麻醉，輔助呼吸，左冠狀動脈遠(yuǎn)端放置縮窄環(huán)，術(shù)后連續(xù)4 d常規(guī)消毒抗炎，制備冠心病心肌瘀血模型。假手術(shù)組開胸但不放置縮窄環(huán)。術(shù)后第12周起，低劑量、中劑量、高劑量組每天早上8：00以血府逐瘀湯按10、20、40 g/kg體重灌胃(intragastric administration，ig)，1次/d，連續(xù)治療21 d。對照組、假手術(shù)組、模型組則灌胃等體積生理鹽水。家兔給藥劑量的計(jì)算依據(jù)，參照文獻(xiàn)[3]中藥復(fù)方藥動學(xué)研究中給藥劑量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行折算。

1.2.2 血府逐瘀湯制備 按2015版《中國藥典》，血府逐瘀湯由桃仁70 g，紅花、當(dāng)歸、柴胡各60 g，生地黃50 g，枳殼40 g，川芎、赤芍、桔梗、甘草各30 g，牛膝20 g組成。按照比例稱取各藥，本院藥理教研室提供并鑒定。先給予藥物清水漂洗2次，加雙蒸水浸泡30 min后煎煮30 min，收集煎煮液，藥渣再加水煎煮20 min，合并2次濾液，水浴加熱濃縮至含生藥2 g/mL滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 AngⅡ、ROS、CK、LDH、T-AOC、SOD、GSH、MDA水平檢測 取靜脈血8 mL，加入冰浴的酶抑制劑30 μL和0. 3 mmol EDTA-Na2，4℃ 1 000 r/min離心5 min，分離血清，置-70℃凍存，采用放射免疫分析法在冰浴中測定AngⅡ；采用比色法測定血清ROS、T-AOC；全自動生化儀測定CK、LDH；黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性；二硫代二硝基苯甲酸法測定GSH；硫代巴比妥酸顯色法測定MDA，均嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行檢測。

1.2.4 NOX2表達(dá)檢測 取心尖部位心肌組織，40 mg/mL多聚甲醛固定48 h，經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋心肌組織切片，厚度3 μm～4 μm，60℃烘箱內(nèi)烘烤1.5 h，二甲苯、乙醇脫蠟與水化，切片浸入pH6.0 PBS緩沖液中，微波加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，30 mL/L甲醇-H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，50 mg/mL BSA封閉液封閉20 min，滴加一抗，4℃孵育12 h，再滴加二抗，DAB顯色，細(xì)胞核復(fù)染，經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明，樹膠封片,生物光學(xué)顯微鏡觀察并拍片。

2 結(jié)果

2.1 各組AngⅡ、ROS、CK、LDH水平檢測結(jié)果

與對照組比較，模型組AngⅡ、ROS、CK、LDH水平顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，低劑量組各指標(biāo)改善不明顯，中劑量、高劑量組AngⅡ、ROS、CK、LDH水平顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)(表1)。

2.2 各組T-AOC、SOD、GSH、MDA水平檢測結(jié)果

與對照組比較，模型組T-AOC、SOD、GSH水平顯著或極顯著下降(P<0.05或P<0.01)，而MDA水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，中劑量、高劑量組T-AOC、SOD、GSH水平顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)，而MDA水平顯著下降(P<0.05)(表2)。

表1 各組AngⅡ、ROS、CK、LDH水平比較

注：與對照組比較，△P<0.05；△△P<0.01;與模型組比較，*P<0.05；**P<0.01。

Note：Compare with control group,△P<0.05；△△P<0.01;Compare with model group, *P<0.05；**P<0.01.

表2 各組T-AOC、SOD、GSH、MDA水平比較

注：與對照組比較，△P<0.05；△△P<0.01;與模型組比較，*P<0.05；**P<0.01。

Note：Compare with control group,△P<0.05；△△P<0.01;Compare with model group, *P<0.05；**P<0.01.

2.3 NOX2表達(dá)檢測

如圖1，棕褐色細(xì)胞為陽性表達(dá)細(xì)胞。對照組棕褐色細(xì)胞密度很小；假手術(shù)組棕褐色細(xì)胞也較少，密度和對照組相似；模型組棕褐色細(xì)胞明顯增多，密度增大；低劑量組棕褐色細(xì)胞較多，減少不明顯；中劑量組和高劑量組棕褐色細(xì)胞減少，密度降低，以高劑量組明顯。

3 討論

冠心病的特征病理變化為心肌細(xì)胞完整性損害、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能破壞、成纖維細(xì)胞異常增生。冠心病心血管損傷與氧化應(yīng)激反應(yīng)的研究顯示，心肌缺血時(shí)，由于代謝產(chǎn)物、病理產(chǎn)物的蓄積，氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)物超出了抗氧化反應(yīng)清除機(jī)制的能力，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)物聚集在心肌細(xì)胞，使心臟泵功能減退[4]。在心肌瘀血中，氧化應(yīng)激及其介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷反應(yīng)在冠心病的發(fā)生發(fā)展、病理轉(zhuǎn)歸與預(yù)后中發(fā)揮重要作用[5]。氧化應(yīng)激反應(yīng)激活A(yù)ngⅡ，促使其表達(dá)增加，AngⅡ一方面通過Ras-Raf-ERK途徑介導(dǎo)強(qiáng)縮血管物質(zhì)的產(chǎn)生，進(jìn)而通過上調(diào) NOX亞型特別是NOX2的表達(dá)從而啟動了氧化損傷反應(yīng)，包括對心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的嚴(yán)重?fù)p害[6]。其中，心肌細(xì)胞完整性受到損害后，CK和LDH釋出，血清水平顯著提高，其水平高低反映了心肌細(xì)胞受損程度，是臨床診斷心肌梗死的重要參考指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，模型組AngⅡ、ROS、CK、LDH、NOX2表達(dá)水平均比對照組升高或顯著升高，提示心肌細(xì)胞受到氧化損傷。另一方面，AngⅡ直接作用于NOX2，激活NOX2誘導(dǎo)產(chǎn)生大量ROS，使血管舒張因子失活，抑制了其對血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用，并阻礙了炎癥反應(yīng)的緩解作用[7-8]，同時(shí)，ROS還通過抑制心肌K+的去極化作用于 L型慢Ca2+通路，產(chǎn)生負(fù)性肌力作用，并進(jìn)一步通過其促心肌細(xì)胞凋亡與內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用使心臟受損[9-10]。因此，對于CHD的治療，早期扭轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激對心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的損傷是防止CHD發(fā)展并防止心功能惡化的重要策略。

A.對照組；B.模型組；C.假手術(shù)組；D.低劑量組；E.中劑量組；F.高劑量組

A.Control group；B.Model group；C.Sham group；D.Low-dose group；E.Middle-dose group；F.High-dose group

圖1 NOX2表達(dá)(IHC,200×)

Fig.1 Expression of NOX2 (IHC,200×)

機(jī)體存在抗氧化損傷的機(jī)制，T-AOC、SOD、GSH水平反映了機(jī)體清除自由基的抗氧化能力；MDA是氧化產(chǎn)物，間接反映自由基水平，通過檢測上述指標(biāo)，可推知機(jī)體氧化和抗氧化能力的狀況。本試驗(yàn)表明，模型組T-AOC、SOD、GSH水平下降或顯著下降，而MDA水平升高，提示心肌缺血，機(jī)體抗氧化能力的下降。

血府逐瘀湯具有改善血液循環(huán)、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能等效果，可用于治療CHD等[11-12]，采用血府逐瘀湯干預(yù)后，反映氧化損傷程度的AngⅡ、ROS、CK、LDH、NOX2水平均趨向于對照組水平；同時(shí)，反映機(jī)體抗氧化能力的T-AOC、SOD、GSH水平也趨于正常，表明血府逐瘀湯具有減輕氧化損傷的作用。本試驗(yàn)也提示，從劑量看，低劑量對各指標(biāo)改善效果不明顯，整體上以中劑量和高劑量作用效果較好，推測其原因，可能低劑量需要更長的給藥時(shí)間才能顯示其效果，而本試驗(yàn)給藥時(shí)間只有3周，因此，提示臨床應(yīng)用血府逐瘀湯，需要考慮其用量，同時(shí)也不要忽略其治療用藥時(shí)間。綜上所述，本試驗(yàn)提示，血府逐瘀湯治療CHD的機(jī)制與其抗氧化損傷作用有關(guān)，相關(guān)的機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究，為認(rèn)識血府逐瘀湯及拓寬其應(yīng)用提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)資料。