阿熱阿依·海依拉提，彭 斌，張曉玲，姚 剛，克然木·托乎提，冷朝升,雷程紅*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.庫爾勒市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆庫爾勒 841000)

沙門菌(Salmonella)是一群存在于人和動物腸道內(nèi)的革蘭陰性桿菌，是一種重要的人獸共患病病原，在醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生上均十分重要[1]。畜禽感染沙門菌主要表現(xiàn)為發(fā)熱、胃腸炎、腹瀉、敗血癥及母畜流產(chǎn)等[2]。沙門菌在動物與動物、動物與人、人與人之間通過消化道間接或直接傳播[3]。目前由沙門菌引起的食源性疾病已成為世界范圍內(nèi)重要的公共衛(wèi)生問題。在細菌性食物中毒中，由沙門菌引起的食物中毒病例居于首位[4]。在引起沙門菌中毒的食品中，約90%是肉、蛋、奶等畜禽產(chǎn)品，雞肉、羊肉、牛肉等已被認為是人感染沙門菌的主要來源。畜禽感染沙門菌也常會表現(xiàn)為無癥狀帶菌，會降低動物的生產(chǎn)繁殖能力，或者可能加重病態(tài)或增加死亡率，呈現(xiàn)出有臨床癥狀的致死性疾病，造成經(jīng)濟損失，對畜牧業(yè)的健康發(fā)展和人類健康構(gòu)成潛在威脅[5]。許多調(diào)查發(fā)現(xiàn)由于養(yǎng)殖業(yè)長期不合理使用抗菌藥物，導(dǎo)致沙門菌的耐藥性增強和耐藥譜增寬，使得沙門菌感染的治療難度增加，同時可能使耐藥菌株從農(nóng)場流向餐桌，使人類感染耐藥沙門菌株，最終導(dǎo)致使用抗菌藥物治療失敗[6]。目前，沙門菌對早期用于該菌治療的青霉素、四環(huán)素、氯霉素及磺胺類等藥物的耐藥性增長十分嚴重[7]。肉牛養(yǎng)殖是新疆畜牧業(yè)的重要組成部分，肉牛健康養(yǎng)殖對于保障牛肉的衛(wèi)生質(zhì)量具有重要意義。目前在新疆地區(qū)表觀健康肉牛沙門菌帶菌情況及分離株耐藥性尚缺乏相關(guān)數(shù)據(jù)。因此，本研究對新疆地區(qū)表觀健康肉牛攜帶的沙門菌進行了分離鑒定，并對沙門菌分離株的耐藥性進行了檢測分析，旨在為肉牛的健康養(yǎng)殖及臨床合理使用抗菌藥物提供科學(xué)依據(jù)，為預(yù)防和控制人感染沙門菌提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物及參考菌株 新疆庫爾勒市周邊某肉牛養(yǎng)殖場各個生長階段的肉牛753頭。陽性對照菌株為鼠傷寒沙門菌ATCC13311,新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物性食品衛(wèi)生學(xué)實驗室保存；陰性對照菌株為大腸埃希菌ATCC25922，杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品；PCR 儀、高速離心機、移液器，德國Eppendorf 公司產(chǎn)品；凝膠成像儀，美國伯樂公司產(chǎn)品；水平電泳槽、電泳儀，北京六一儀器廠產(chǎn)品；超凈工作臺，上海博訊有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑 蛋白胨緩沖液(buffered peptone water，BPW)、四硫磺酸鈉煌綠增菌液(tetrathionate broth base，TTB)、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(selenite cystine broth，SC)、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂培養(yǎng)基(xylose lysine desoxycholate，XLD)、亞硫酸鉍培養(yǎng)基(bismuth sulfite，BS)、沙門菌顯色培養(yǎng)基，青島日水生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；沙門菌生化鑒定套盒，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；PCR反應(yīng)試劑、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000，北京天根生化試劑公司產(chǎn)品；甲氧芐啶(含量98%)、氯霉素(含量98%)、氟苯尼考(含量98%)、鏈霉素(含量77.4%)、氨芐西林(含量86.5%)、諾氟沙星(含量98%)、環(huán)丙沙星(含量98%)，北京索萊寶生物公司產(chǎn)品；四環(huán)素(含量95%)、磺胺異惡唑(含量98%)、阿莫西林(含量98%)，中國食品藥品檢定研究院產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與處理 2017年4月在新疆庫爾勒市周邊某肉牛場采集表觀健康肉牛的肛拭子樣品753份，將采集的肛拭子樣品置于無菌Cary-Blair氏運送培養(yǎng)基內(nèi)冷藏，8 h內(nèi)運回實驗室。

1.2.2 沙門菌的分離純化 在無菌條件下，將運送培養(yǎng)基中的肛拭子移置至加有滅菌的1.5 mL BPW前增菌液的離心管中，在37℃振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h；后各取1 mL BPW轉(zhuǎn)種于10 mL TTB增菌液和SC增菌液中并混勻，然后分別在42℃±1℃和36℃±1℃條件下培養(yǎng)18 h～24 h。培養(yǎng)結(jié)束的增菌液同時劃線接種于XLD、BS選擇性培養(yǎng)基上和沙門菌顯色培養(yǎng)基上，然后在37℃條件下分別培養(yǎng)18 h～24 h和40 h～48 h進行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后觀察各平板上有無典型或可疑沙門菌。同時采用沙門菌參考菌株和大腸埃希菌參考菌株作對照。

1.2.3 沙門菌的生化鑒定 參考食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.4-2016《食品微生物學(xué)檢驗沙門菌檢驗》[8]中的方法，用沙門菌生化鑒定試劑盒進行生化鑒定。

1.2.4 沙門菌分離株P(guān)CR鑒定

1.2.4.1 引物 根據(jù)文獻[9]針對沙門菌invA基因(表1)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。

表1 靶基因名稱及引物序列

1.2.4.2 分離株DNA的提取 向已滅菌的2 mL EP管中加入2 000 μL菌液，以13 000 r/min離心10 min后棄去上清液，向其中加入100 mL TE buffer渦旋振蕩30 s，后置于100℃水浴煮沸10 min，取出立即置于冰盒內(nèi)冰浴10 min，再以12 000 r/min離心2 min，取上清液保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.3 invA基因PCR擴增 根據(jù)文獻和預(yù)試驗結(jié)果，PCR反應(yīng)體系包括：Mix 10 μL，invA基因上、下引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，補ddH2O至終體積為25 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58.5℃ 30 s，共35個循環(huán)；72℃ 50 s,72℃ 5 min，置4℃保存。

1.2.4.4 PCR產(chǎn)物電泳檢測 將產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果，能擴增出大小為284 bp的invA基因特異性片段的菌株為沙門菌陽性菌株。

1.2.5 藥敏試驗 采用美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法，測定最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)，進行10種臨床常見抗菌藥物耐藥性試驗，并分析沙門菌分離株的耐藥情況。

根據(jù)CLSI(2016)標(biāo)準(zhǔn)對藥敏結(jié)果進行判讀，統(tǒng)計出沙門菌分離菌株的耐藥菌株數(shù)，計算出對各種抗菌藥的耐藥率。

耐藥率=(對該抗菌藥物耐藥的菌株數(shù)目/菌株總數(shù))×100%

2 結(jié)果

2.1 疑似沙門菌分離結(jié)果

753份樣品通過選擇性增菌液、選擇性培養(yǎng)基及顯色培養(yǎng)基篩選得到疑似沙門菌分離株90株。部分疑似沙門菌分離株在XLD培養(yǎng)基和BS培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)分別見圖1和圖2。

2.2 疑似沙門菌PCR鑒定結(jié)果

采用參考菌株和空白試驗對所設(shè)計的2對引物進行PCR特異性驗證，結(jié)果表明，鼠傷寒沙門菌ATCC13311擴增出目的片段，其余對照均未擴增出任何目的片段，說明所設(shè)計的引物特異性可靠(圖 3 )。

圖1 沙門菌在XLD培養(yǎng)基上菌落形態(tài)

圖2 沙門菌在BS培養(yǎng)基上菌落形態(tài)

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000;+.陽性對照；-.陰性對照；1～6.部分疑似沙門菌菌株

M.DNA Marker DL 1 000;+.Positive control; -.Negative control;1-6.Some suspectedSalmonellastrains

圖3疑似沙門菌PCR擴增產(chǎn)物

Fig.3 PCR amplified products from suspectedSalmonella

2.3 表觀健康肉牛沙門菌帶菌檢測結(jié)果

753份樣品經(jīng)選擇性增菌液、選擇性培養(yǎng)基、顯色培養(yǎng)基、革蘭染色、生化鑒定及PCR鑒定后，最終確定得到63株沙門菌分離株，每株沙門菌均來自不同的樣品，故表觀健康肉牛沙門菌帶菌率為8.37%(63/753)(表2)。

表2 表觀健康肉牛沙門菌帶菌率

2.4 牛源沙門菌分離株耐藥性

63株沙門菌分離株對10種藥物的耐藥程度明顯不同，63株沙門菌對甲氧芐啶的耐藥率最高，達97.2%；其次為氯霉素，耐藥率為94.7%；對四環(huán)素的耐藥率為74.7%；對磺胺異惡唑和鏈霉素的耐藥率分別為61.5%和54.2%；對氨芐西林、阿莫西林的耐藥率則分別為29.9%和45.5%；其余3種藥物諾氟沙星、環(huán)丙沙星和氟苯尼考的耐藥率相對較低，分別為16.6%、14%和11.3%(表3)。整體耐藥率比較情況見圖4。

表3 沙門菌耐藥率結(jié)果

圖4 沙門菌耐藥率比較

63株沙門菌中未出現(xiàn)全敏感性菌株，有4株可抗2種抗菌藥物(6.35%)，有13株可抗3種抗菌藥物，所占耐藥比重最大為20.63%，可抗4種抗菌藥物與5種抗菌藥物的菌株數(shù)均為11株(17.46%)，抗6種及以上的菌株數(shù)達24株(38.09%)。63株沙門菌產(chǎn)生了34種耐藥譜，耐藥譜型復(fù)雜，主導(dǎo)耐藥譜為以下3種，分別為TE-TMP-C、SIZ-S-TE-TMP-C、SIZ-S-AM-AMX-TE-TMP-C。耐藥種數(shù)與耐藥菌株數(shù)見表4。

表4 多重耐藥與耐藥菌株數(shù)

3 討論

在養(yǎng)殖過程中肉牛隱性攜帶沙門菌會通過排泄物、分泌物持續(xù)向環(huán)境中排放沙門菌導(dǎo)致環(huán)境污染和其他動物的感染，在屠宰、分割、運輸及儲存環(huán)節(jié)也會增加牛肉受沙門菌污染的風(fēng)險。目前國內(nèi)雞源、豬源沙門菌已有較多研究報道，但有關(guān)表觀健康肉牛攜帶沙門菌研究的報道較少。朱曉霞[10]研究發(fā)現(xiàn)，四川廣漢屠宰場體征健康待宰牦牛沙門菌攜帶率為50%(13/26)。吳美云[11]對內(nèi)蒙古地區(qū)健康奶牛直腸糞樣進行沙門菌的分離鑒定，檢出率為10.9%(38/350)。匡秀華[12]對湖北省、湖南省及河南省健康奶牛沙門菌進行了分離鑒定，分離率25.12%(105/428)。Perez-Montao J A等[13]的研究結(jié)果顯示，墨西哥哈里斯科州牛源沙門菌污染率為15.4%。本試驗結(jié)果顯示，新疆庫爾勒市規(guī)模化肉牛養(yǎng)殖場表觀健康肉牛沙門菌帶菌率為8.37%(63/753)，其帶菌率低于上述研究報道的結(jié)果，說明該肉牛場沙門菌帶菌率控制在相對較好的水平，但依然存在一定程度的污染，所以為降低牛場沙門菌的感染率及屠宰、分割、運輸及儲存環(huán)節(jié)牛肉被沙門菌污染的風(fēng)險，仍然需要加強肉牛場健康牛攜帶沙門菌的監(jiān)測及養(yǎng)殖場的衛(wèi)生和生物安全措施。

近年來，世界各地報道的沙門菌耐藥問題越來越嚴重。在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域使用的抗菌藥物種類多、數(shù)量大，在食用動物生產(chǎn)中的使用量遠遠高于人用量，造成沙門菌等細菌的耐藥狀況十分嚴重，嚴重威脅人類及動物疾病的治療[14]，已成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。世界動物衛(wèi)生組織(WHO)的報道顯示，中國已成為目前世界上抗菌藥物濫用最嚴重的國家之一，細菌耐藥性逐漸普遍增強。耐藥菌株可以直接或間接感染人，也增加了將相同的耐藥性通過食物鏈傳遞給人體病原菌的風(fēng)險[15]。尹明遠[16]對烏魯木齊肉源沙門菌對13種抗菌藥物耐藥的研究結(jié)果顯示，99株沙門菌對甲氧芐啶(100%)、氯霉素(88.9%)、四環(huán)素(63.6%)、磺胺異惡唑(57.6%) 4種抗菌藥物的耐藥率均在50%以上，84.8%的菌株三重耐藥。趙俊麗等[17]研究了內(nèi)蒙古奶牛源沙門菌對22種抗菌藥物耐藥性，結(jié)果38株沙門菌對甲氧芐啶、磺胺異惡唑和氯霉素耐藥率分別高達97.4%、94.7%和80%，76.3%的菌株對10種及10種以上抗菌藥物耐藥。葛琨等[18]對30株牛、羊肉源沙門菌耐藥性研究的結(jié)果顯示，分離株對甲氧芐啶、氯霉素和四環(huán)素的耐藥率分別為100.0%、86.7%和60.0%。綜上所述，沙門菌的耐藥狀況相當(dāng)嚴重，多地區(qū)沙門菌對甲氧芐啶、氯霉素、四環(huán)素及磺胺異惡唑高度耐藥。原因可能是這些藥物在畜禽疾病治療中使用時間長，使用量和使用頻率較大，沙門菌在藥物的選擇壓力作用下導(dǎo)致耐藥性逐漸增高。為降低沙門菌耐藥菌株對健康養(yǎng)殖和人類健康帶來的安全問題，相關(guān)職能機構(gòu)應(yīng)該加強養(yǎng)殖環(huán)節(jié)抗菌藥物規(guī)范使用的監(jiān)管，合理選擇藥物，精確控制用藥劑量，加強沙門菌的耐藥性監(jiān)測，積極應(yīng)對細菌耐藥性這一全球性公共衛(wèi)生問題。