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(濟(jì)南大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250022)

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是指由非酒精性因素引起的，以肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過量蓄積為主要特征的臨床病理綜合征[1]，包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及肝硬化，至今其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[2-4]。據(jù)報(bào)道，肝脂肪蓄積是由肝內(nèi)甘油三酯(triglycerides, TG)的消除和合成機(jī)制發(fā)生改變引起的，這一過程涉及眾多分子，如過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARα)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP-1c)等。PPARα可通過β-氧化參與脂質(zhì)的消除，而SREBP-1c則參與其合成途徑。

多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls，PCBs)屬于持久性有機(jī)污染物，是由氯化聯(lián)苯的異構(gòu)體組成的一類含氯有機(jī)化合物，被應(yīng)用于各生產(chǎn)領(lǐng)域[5]，由于其物化性質(zhì)穩(wěn)定，因此對(duì)全球造成了污染。 PCB156作為一種多氯聯(lián)苯單體(2, 3, 3′, 4, 4′, 5-多氯聯(lián)苯)，廣泛存在于人類生態(tài)環(huán)境中。如劉耕耘等[6]檢測(cè)北京土壤中PCBs組成時(shí)，發(fā)現(xiàn)土壤中存在PCB156；韓景超等[7]研究浙江溫州不同城市功能區(qū)徑流中PCBs的污染特性時(shí)，檢測(cè)到不同徑流中含有多種PCBs，其中包括PCB156。近年來，多項(xiàng)研究[8-9]顯示PCBs暴露能增加部分人患NAFLD的風(fēng)險(xiǎn)。本課題組前期研究[10]發(fā)現(xiàn)，2, 3, 7, 8-四氯二苯并二口惡英(TCDD)與多氯聯(lián)苯混合物Aroclor1254聯(lián)合暴露可使小鼠肝臟積累大量脂肪顆粒，且肝臟病理切片顯示有大量的空泡形成和炎性細(xì)胞的浸潤等病理特征，然而，PCB156的毒性作用及其作用機(jī)制尚不明確[11]。

HepG2細(xì)胞作為體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，其病變過程僅局限于單純脂肪變性，是研究NAFLD脂肪變性的良好模型[12]。本文中以HepG2細(xì)胞作為體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停疾霵CB156暴露與NAFLD的關(guān)系，并探討其潛在分子作用機(jī)制，希望對(duì)有效減緩PCBs暴露導(dǎo)致人體健康危害具有指導(dǎo)的意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

主要材料包括：HepG2細(xì)胞株，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心提供；多氯聯(lián)苯單體PCB156，北京百靈威科技有限公司；胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶及最小必需培養(yǎng)基(MEM)，美國賽默飛世爾科技(中國)有限公司；磷酸緩沖液(PBS)、細(xì)胞級(jí)二甲亞砜(DMSO)，北京索萊寶科技有限公司；核糖核酸(RNA)提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司；多聚甲醛(分析純)及油紅O，上海和序生物科技有限公司；甘油三酯(TG)測(cè)試盒、總蛋白測(cè)試盒，江蘇省南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

HepG2細(xì)胞用體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS的MEM，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。 待細(xì)胞長至直徑為60 mm的培養(yǎng)皿容積的85%時(shí)，加胰蛋白酶(625個(gè)酶單位)進(jìn)行消化，按細(xì)胞數(shù)密度5×104mL-1接種至24孔板，每個(gè)孔接種700 μL。待鋪板細(xì)胞貼壁約60%，分別用濃度為3.4、34 μmol/L的PCB156加入到生長狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞中進(jìn)行暴露，以DMSO暴露作為對(duì)照組，每組設(shè)置3個(gè)平行試樣，均暴露72 h。

1.2.2 油紅O染色

取0.5 g油紅O溶于100 mL異丙醇中制成儲(chǔ)存液，實(shí)驗(yàn)時(shí)取6 mL加蒸餾水至10 mL，靜置過濾配成工作液。 暴露實(shí)驗(yàn)完成后，24孔板HepG2細(xì)胞用PBS(濃度為10 mmol/L)洗滌3遍，甲醛固定30 min，油紅O工作液染色20 min，用異丙醇體積分?jǐn)?shù)為60%的溶液洗滌3遍，分色至背景無色，蒸餾水洗至脫去浮色后于倒置相差顯微鏡下觀察。

1.2.3 甘油三酯及總蛋白測(cè)定

按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 基因表達(dá)量實(shí)時(shí)熒光定量測(cè)試

PCB156暴露72 h后，收集各組細(xì)胞，按試劑盒說明書分別提取各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總RNA，并將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)。參考文獻(xiàn)并用Primer 5軟件設(shè)計(jì)β-肌動(dòng)蛋白(β-actin，內(nèi)參)、PPARα、SREBP-1c引物序列(見表1)，進(jìn)行熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Q-PCR)，反應(yīng)條件如下： 95 ℃，3 min預(yù)變性；95 ℃，30 s變性；56 ℃，30 s退火；72 ℃，30 s延伸；72 ℃，10 min終延伸；4 ℃保溫；共35個(gè)循環(huán)，使用2-ΔΔCt法計(jì)算基因表達(dá)量。

表1 β-actin、PPARα、SREBP-1c引物序列

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，2個(gè)樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)(顯著性水平p≤0.05為顯著性差異)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 PCB156暴露促進(jìn)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)的生成

油紅O作為一種強(qiáng)染脂劑，能夠指示細(xì)胞中脂質(zhì)的含量，因此本文中對(duì)PCB156暴露72 h后的HepG2細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，濃度為3.4 μmol/L的PCB156暴露組相對(duì)于DMSO對(duì)照組，其HepG2細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量明顯多于對(duì)照組(見圖1(a)(b)。 當(dāng)暴露濃度為34 μmol/L時(shí)，HepG2細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量顯著多于對(duì)照組(見圖1(c)(d))。

(a)對(duì)照組CT-0.1(放大倍數(shù)400×)(b)實(shí)驗(yàn)組PCB156-3.4(放大倍數(shù)400×)(c)對(duì)照組CT-1(放大倍數(shù)400×)(d)實(shí)驗(yàn)組PCB156-34(放大倍數(shù)400×)CT-0.1—對(duì)照組二甲亞砜的濃度為 0.1 μmol/L; PCB156-3.4—PCB156暴露濃度為3.4 μmol/L;CT-1—對(duì)照組二甲亞砜的濃度為1 μmol/L; PCB156-34—PCB156暴露濃度為34 μmol/L。圖1 多氯聯(lián)苯PCB156暴露后HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積

2.2 PCB156暴露增加HepG2細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的濃度

PCB156暴露增加HepG2細(xì)胞甘油三酯濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。 與對(duì)照組相比，濃度分別為3.4、34 μmol/L的PCB156暴露均能增加HepG2細(xì)胞中TG的濃度(3.4 μmol/L時(shí)為1.18倍，34 μmol/L時(shí)為1.23倍)，但是顯著性水平p>0.05，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3 PCB156暴露誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞PPARα與SREBP-1c基因的表達(dá)

為了進(jìn)一步探討PCB156促進(jìn)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)生成的潛在分子機(jī)制，考察了PCB156暴露對(duì)HepG2細(xì)胞中參與脂質(zhì)生成過程中重要調(diào)控基因PPARα與SREBP-1c的表達(dá)水平的影響，結(jié)果如圖3所示。 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，相對(duì)于對(duì)照組，濃度為 3.4 μmol/L 的 PCB156 暴露 HepG2 細(xì)胞，能顯著上調(diào)PPARα(2.2倍，p<0.05)與SREBP-1c(2.4倍，p<0.05)基因的表達(dá)水平。

CT-0.1—對(duì)照組二甲亞砜的濃度為 0.1 μmol/L；PCB156-3.4—PCB156暴露濃度為3.4 μmol/L；CT-1—對(duì)照組二甲亞砜的濃度為1 μmol/L；PCB156-34—PCB156暴露濃度為34 μmol/L。圖2 多氯聯(lián)苯PCB156暴露增加HepG2細(xì)胞甘油三酯濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(a)PPARα

(b)SREBP-1cCT-0.1—對(duì)照組二甲亞砜的濃度為 0.1 μmol/L；PCB156-3.4—PCB156暴露濃度為3.4 μmol/L。圖3 過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARα)與固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP-1c)基因表達(dá)量

3 分析與討論

NAFLD是一種主要受遺傳與環(huán)境相互作用調(diào)節(jié)的多因素疾病[12]。 本文中探討了環(huán)境中持久性有機(jī)污染物PCB156與NAFLD的關(guān)系。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCB156暴露能夠促進(jìn)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)的生成。

PCB156作為一種類二口惡英多氯聯(lián)苯，其結(jié)構(gòu)與二口惡英的平面結(jié)構(gòu)相似，具有與二口惡英比較相近的毒平面結(jié)構(gòu)，因此具有與二口惡英比較相近的毒性作用。Duval等[13]研究發(fā)現(xiàn)，長期低劑量二口惡英暴露C57BL6小鼠能夠加劇小鼠NAFLD病變。Boucher等[14]研究證明，類二口惡英多氯聯(lián)苯PCB126暴露同樣能夠促進(jìn)高脂喂養(yǎng)的C57/BL6小鼠NAFLD的發(fā)病進(jìn)程。在本文的研究中，PCB156暴露能夠增加HepG2細(xì)胞內(nèi)脂滴的數(shù)量和甘油三酯的濃度，具有導(dǎo)致NAFLD的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步驗(yàn)證了類二口惡英多氯聯(lián)苯與NAFLD的相關(guān)性。

PCB156促進(jìn)肝細(xì)胞脂質(zhì)生成的作用機(jī)制通常與肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝紊亂有關(guān)。文獻(xiàn)[15]中的研究結(jié)果表明，脂質(zhì)代謝紊亂與PPARα分子信號(hào)通路激活密切相關(guān)，且經(jīng)過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PPARα的活化[16]可以促進(jìn)肝臟甘油三酯的合成，導(dǎo)致肝臟脂肪病變。SREBP-1c作為調(diào)控肝臟脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵因子，能夠激活脂肪酸和膽固醇的生物合成，抑制TG的轉(zhuǎn)運(yùn)[17-19]。Shimano[20]研究發(fā)現(xiàn)，SREBP-1c直接參與脂肪酸和TG合成的表達(dá)調(diào)控是參與脂肪合成的主要調(diào)節(jié)因子。McPherson等[21]認(rèn)為SREBP-1c的過表達(dá)可引起脂肪合成相關(guān)酶基因的表達(dá)量過大，導(dǎo)致脂肪在非脂肪組織中堆積。在本文的研究中發(fā)現(xiàn)，PCB156暴露能夠顯著誘導(dǎo)PPARα和SREBP-1c信使核糖核酸(mRNA)的表達(dá)，表明PPARα和SREBP-1c在PCB156引起的NAFLD中起著潛在重要的調(diào)控作用。

PPARα、SREBP-1c作為NAFLD進(jìn)程中重要的調(diào)控分子，其表達(dá)量的增加使細(xì)胞內(nèi)TG蓄積，從而引發(fā)NAFLD進(jìn)程。在PCB156誘導(dǎo)NAFLD發(fā)病進(jìn)程中，關(guān)于PPARα、SREBP-1c等信號(hào)通路分子機(jī)制的問題還有待進(jìn)一步研究，以期為治療NAFLD提供新思路。