趙 楊，王 沛，馮竟翠，譚書院，于 波

（長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長春 130117）

連錢草屬于唇形科植物活血丹的干燥地上部分，別名金錢草、透骨消等，具有清熱解毒、利尿排石、散瘀消腫的功效，用以治療熱淋、尿路結(jié)石、肝膽結(jié)石、濕熱黃疸等疾病[1]。主要化學(xué)成分有萜類、黃酮和黃酮苷類、有機酸類、揮發(fā)油類、甾體類、醇類等。其中萜類包括齊墩果酸、熊果酸等；黃酮和黃酮苷類包括木犀草素、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、芹菜素、芫花素、槲皮素、連錢草酮等[2-5]。微丸是一種新的劑型，由藥物與輔料構(gòu)成的直徑＜2.5 mm的球狀實體。體積較小從而提高藥物與腸胃的接觸面積，同時具有載藥量大的優(yōu)點，可以通過不同釋藥速率的幾種小球的組合，得到理想的釋藥速率、相對穩(wěn)定的血藥濃度，并維持較長的藥物作用時間，避免對胃黏膜刺激等一些不良反應(yīng)[6-7]。

1 材料

1.1 儀器 E-35型擠出制粒機：重慶英格制藥機械有限公司；R-250型滾圓機：重慶英格制藥機械有限公司；TU-1810型紫外分光光度儀：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；KQ-250型超聲波清洗器：江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；RCZ-6C2型藥物溶出度儀：上海黃海藥檢儀器有限公司。

1.2 試藥 連錢草（批號1602001）：河北全泰藥業(yè)有限公司；連錢草總黃酮（自制；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65.59%）；微晶纖維素：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；蘆?。ㄅ枺?13344，規(guī)格：分析標(biāo)準(zhǔn)品，HPLC≥98% 100 mg）：上海源葉生物科技有限公司；亞硝酸鈉（批號：011516）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；硝酸鋁（批號：011755）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙醇、氫氧化鈉均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取與制備

2.1.1 連錢草總黃酮的提取與純化 提?。簩?00 g連錢草藥材烘干后，在粉碎機中粉碎得粗粉，用45%乙醇按液固比12:1的比例混合，放入超聲機中超聲2 h，設(shè)置溫度為40 ℃，得連錢草總黃酮[8]。純化：將D101型大孔樹脂濕法裝柱，加連錢草總黃酮以1 mL/min的速度進(jìn)行動態(tài)吸附，用乙醇30%洗脫，收集洗脫液，并在水浴濃縮成浸膏。干燥：將濃縮后的浸膏干燥成粉，得連錢草總黃酮粉，測量吸光度計算總黃酮含量為65.59%。

2.1.2 連錢草黃酮微丸制備工藝 將得到的連錢草總黃酮與微晶纖維素混合，并用水做為黏合劑使其達(dá)到手握成團(tuán)，觸之即散的理想狀態(tài)，在一定的擠出滾圓時間與速度制備出微丸，并篩分出30～40目的微丸進(jìn)行研究。微晶纖維素具有很強的溶脹性和可塑性，與其他的輔料相比較，微晶纖維素制成的微丸有更高的硬度和強度，且成丸容易，不會出現(xiàn)微丸崩裂現(xiàn)象，是普通微丸最常用的一種賦形劑，也是擠出滾圓的技術(shù)中最重要的一種輔料。所以本品采用微晶纖維素做為輔料。

2.2 含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加60%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（約含蘆丁0.2 mg/mL）[9]。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取連錢草總黃酮微丸適量研磨成粉末，取粉末1 g，置于100 mL密封容器中，精密加入50 mL 60%乙醇，密塞，稱重，超聲提取2 h，密塞，再次稱重，續(xù)用60%乙醇補足減失重量，搖勻，過濾，即得供試品[10]。

2.2.3 吸收波長的確定 取蘆丁對照品溶液5 mL于25 mL容量瓶中，加蒸餾水6 mL，取5% NaNO3溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加入10% Al（NO3）3溶液1 mL，搖勻，靜置6 min；再加入4% NaOH溶液1 mL，定容，搖勻，靜置15 min，以同法作空白，在400～700 nm 波長范圍內(nèi)掃描。在505 nm處有最大吸收峰[11]。

精密吸取供試品溶液6 mL于25 mL容量瓶中，用60%乙醇定容，后再去稀釋后的供試品溶液5 mL，同上操作進(jìn)行波長掃描，在505 nm處有最大吸收峰。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取對照品溶液0、1、2、3、4、5、 6 mL于25 mL容量瓶中，加蒸餾水6 mL，取5% NaNO3溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加入10% Al（NO3）3溶液1 mL，搖勻，靜置6 min；再加入4% NaOH溶液1 mL，最后加入蒸餾水到刻度，搖勻，靜置15 min，在505 nm處測定，得回歸曲線方程為：C = 0.093 07A - 0.008 5，r = 0.999 3。表明在8.000 0～48.000 0 μg/mL的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系[12]。

2.3 考察指標(biāo)的測定

2.3.1 收率 即經(jīng)過30～40目篩分的微丸與制備所得的微丸的比值。

2.3.2 圓整度 采用平面臨界穩(wěn)定法測定微丸的圓整度，即將微丸放在一平板上，緩慢抬起平板一側(cè)，當(dāng)80%微丸的滾動時，測量微丸開始滾動時傾斜平面與水平面所成的夾角，其角度越小，表明微丸的圓整度越好。

2.3.3 總黃酮含量 以蘆丁對照品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定總黃酮含量。

2.4 單因素試驗及結(jié)果

2.4.1 投藥量的考察 選擇投藥量為15%、35%、45%進(jìn)行考察，起初先用了15%的投藥量進(jìn)行混合，當(dāng)投藥量少時，藥物與輔料與黏合劑混合后偏干，使擠出物在切割滾圓時切割成粉，成丸率低。當(dāng)投藥量為35%時，藥物本身黏度增大，與輔料混合后擠出物黏度適中，滾圓后成型率大。當(dāng)投藥量為45%時，由于藥物本身黏度過大，造成擠出物過黏，經(jīng)切割滾圓后成棒狀，球狀較少，所以本試驗使用投藥量在35%左右。

2.4.2 用水比例的考察 稱取制得的藥粉制軟材，按2:1的比例加水混合，藥物仍呈粉末狀。加入1:2比例的水，藥粉末已成黏糊狀。所以加水量的范圍就可以確定在這2個比例中間，經(jīng)多次試驗結(jié)果表明，最適宜的藥水比例為1:1，制出的軟材可以很好的制成微丸。

2.4.3 滾圓速度 將擠出好的擠出物置于滾圓機中，選擇50 Hz進(jìn)行滾圓，結(jié)果發(fā)現(xiàn)速度過快，導(dǎo)致藥物全部貼至滾圓機內(nèi)壁，無微丸形成，后又選擇20、30、40 Hz進(jìn)行滾圓，試驗發(fā)現(xiàn)30 Hz時微丸的圓整度最好[7]。

2.4.4 滾圓時間 滾圓時間對微丸的圓整度和粒徑都有很大的影響，滾圓時間短，滾圓的圓整度則降低，收率減少；滾圓的時間過長，則滾圓的圓整度較好，但粒徑變小，使微丸的形態(tài)變小，得不到較好的微丸。所以要在一定的時間范圍內(nèi)，制備出圓整度好，收率大的微丸。本品中固定微晶纖維素，投藥量為35%，用水量為1:1，采用的滾圓時間為30、50、70 s?？疾炱鋵A整度的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)滾圓時間短時，圓整度大，滾圓效果較差，當(dāng)時間增加則圓整度小，滾圓效果較好。

2.5 正交設(shè)計試驗 根據(jù)單因素考察的結(jié)果，控制連錢草總黃酮與微晶纖維素的比約在15%～45%內(nèi)，用水量控制在2:1～1:2之間，根據(jù)實驗操作，把微晶纖維素固定。選定投藥量（A）、物料與水比例（B）滾圓時間（C）、滾圓速度（D）4個因素為考察對象，每個因素定3個水平[10]。

采用綜合加權(quán)評分的方法對工藝進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)實驗的目的，指標(biāo)微丸的重要性從大到小為：總黃酮含量（y1）＞收率（y2）＞圓整度（y3）。所以權(quán)重系數(shù)分別取為60%、30%，10%。結(jié)果可知，四因素對連錢草總黃酮微丸影響的順序為A＞B＞D＞C，其中載藥量的影響最顯著，其次為用水量，而滾圓速度與時間則影響較小。篩選出的最優(yōu)處方為A2B2C3D1，即投藥量為35%，用水量為1:1，滾圓時間為70 s，滾圓速度為20 Hz。正交試驗L9（34）及結(jié)果，見表1，方差分析及結(jié)果，見表2。

表1 正交試驗L9（34）及結(jié)果

表2 方差分析及結(jié)果

由方差分析結(jié)果可知，四因素對連錢草總黃酮微丸影響的順序為A＞B＞D＞C，其中載藥量的影響最顯著，其次為用水量，而滾圓速度與時間則影響較小。從直觀分析可知A因素的2水平，B因素的2水平，C因素的3水平，D因素的2水平為最佳水平：A2B2C3D2，即投藥量為35%，用水量為1:1，滾圓時間為70 s，滾圓速度為30 Hz。

2.6 驗證性試驗 取連錢草總黃酮3份，按最佳工藝制備微丸，考察收率、圓整度及總黃酮量。所以實驗結(jié)果表明：3批連錢草微丸總黃酮含量的RSD為0.33%，重復(fù)性良好。

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 重復(fù)性試驗 平行取6份樣品，按2.2.2項下制備供試品溶液，精密吸取4 mL，按2.2.4項下操作，進(jìn)樣測定，結(jié)果RSD為0.125%，結(jié)果表明，重現(xiàn)性良好。

2.7.2 精密度試驗 分別吸取對照品溶液及重復(fù)性試驗項下的供試品溶液各1份，測定吸光度。RSD分別為0.1375和0.207%，結(jié)果表明，精密度良好。

2.7.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取重復(fù)性試驗項下供試品溶液1份，按0、5、10、15、20、25 min連續(xù)測定吸光度，RSD為0.280%，結(jié)果表明，供試品溶液在25 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。結(jié)果可靠。

2.7.4 加樣回收率試驗 取已知含量的同一批樣品6份，精密稱定，分別加入蘆丁對照品，按供試品溶液方法制備，測定，計算回收率，平均回收率為98.05%，RSD為1.88%，回收率良好，適合作為本品的含量測定。

2.8 連錢草總黃酮體外釋放度檢測 取自制緩釋微丸，按照《中華人民共和國藥典》（2015版第4部）通則9013以釋藥率對時間作圖，見圖1。圖1在《中華人民共和國藥典》（2015版第4部）9014微粒制劑指導(dǎo)原則中規(guī)定在開始0.5 h內(nèi)的釋放量要求低于40%，且最后釋放率在90%以上。

圖1 連錢草總黃酮體外釋放度曲線

根據(jù)體外釋放曲線可知，優(yōu)化工藝制備的微丸在0.5 h內(nèi)累積釋藥率為27.3%，6 h時的累積釋藥率為92.5%，符合藥典規(guī)定，微丸釋放度良好。

2.9 釋藥模型擬合 連錢草總黃酮微丸在磷酸鹽緩溶液中，以零級釋藥模型、一級釋藥模型和Higuchi釋藥模型進(jìn)行擬合。

以磷酸鹽緩沖溶液為釋藥介質(zhì)，用Higuchi釋藥方程擬合，r = 0.918 3為最大值。因此，認(rèn)為連錢草總黃酮微丸在磷酸鹽緩沖溶液中的Higuchi方程為最佳釋藥模型擬合方程。零級方程與一級方程得到的r值遠(yuǎn)小于Higuchi方程。

3 小結(jié)

本文運用擠出滾圓法制備連錢草總黃酮微丸，通過單因素實驗考察投藥量、用水量、滾圓時間、滾圓速度對微丸的影響進(jìn)行正交，得出最佳方案：投藥量35%；用水量1:1；滾圓時間70 s；滾圓速度30 Hz。并以最佳工藝測定其累積釋藥率，得到符合《中華人民共和國藥典》的結(jié)果。