薛來(lái)恩 黨 源 溫福利 張?jiān)娞m 鄭和平

(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科，福州 350025)

隨著食用菌產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，中國(guó)食用菌產(chǎn)業(yè)每年產(chǎn)生的菌糠總量至少1 500萬(wàn)噸[1]。菌糠是指食用菌生產(chǎn)后的固體培養(yǎng)基質(zhì)廢料[2]，其富含蛋白質(zhì)、多糖等營(yíng)養(yǎng)成分[3-4]，通常被丟棄或焚燒處理[5]，不僅造成資源浪費(fèi)，而且污染生態(tài)環(huán)境。合理地開(kāi)發(fā)利用食用菌菌糠，既可拓寬資源變廢為寶，也可解決污染環(huán)境的問(wèn)題，具有顯著的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益，促進(jìn)食用菌產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

多糖是生物菌主要的活性成分，具有調(diào)節(jié)免疫力、促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖、促進(jìn)免疫細(xì)胞因子分泌及其mRNA表達(dá)等[6-7]。杏鮑菇中的主要成分是真菌多糖，具有抗病毒、降低膽固醇、防止動(dòng)脈硬化、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功能[8]。但從杏鮑菇菌糠中提取多糖并將其作為飼料添加劑的研究報(bào)道鮮見(jiàn)。為此，本文以杏鮑菇菌糠為材料，研究不同劑量的杏鮑菇菌糠多糖對(duì)小鼠脾指數(shù)的影響，檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖情況和血漿中免疫因子IFN-γ、TNF-α、IL-6含量，為進(jìn)一步研究杏鮑菇菌糠多糖增強(qiáng)免疫功能提供依據(jù)，并為多糖飼料添加劑及開(kāi)發(fā)菌糠提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌糠：杏鮑菇菌糠由福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院提供。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)KM小鼠48只，雄性，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：[SCXK(滬)2016-0011]。飼養(yǎng)于南京軍區(qū)福州總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科屏障環(huán)境，使用許可證號(hào)：[SYXK(閩)2013-0004]，環(huán)境溫度(22±1)℃，相對(duì)濕度40%～65%，光照時(shí)間12 h/12 h。

1.1.3試劑：胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司),批號(hào)：20150709；紅細(xì)胞裂解液(天津?yàn)?批號(hào)：NH4CL2009；PBS(HyClone),批號(hào)：AB10111039；DMEM(HyClone),批號(hào)：AC10206284；Pen Strep(GENVIEW)批號(hào)：66280101100；CCK-8(GENVIEW)批號(hào)：7706010130；IFN-γ試劑盒(上海橋杜生物科技有限公司)，批號(hào)：201702；TNF-α試劑盒(CUSABIO)，批號(hào)：F15039563；IL-6試劑盒(CUSABIO)，批號(hào)：D14039564；戊巴比妥(SIGMA)，批號(hào)：#033M8962 V；無(wú)水乙醇、氯仿、正丁醇、苯酚、濃硫酸均為分析純。

1.1.4儀器：TJS-3000超聲波提取濃縮機(jī)(杭州威功超聲設(shè)備有限公司)；FD-1/1C真空冷凍干燥機(jī)(北京德天佑科技發(fā)展有限公司)；R205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(SENCO)；RS232光吸收酶標(biāo)儀(SpectraMax)；CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)；HFsafe 1200生物安全柜(上海力申科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1杏鮑菇菌糠多糖的制備[9]：杏鮑菇菌糠多糖的制備嚴(yán)格按照超聲波提取濃縮機(jī)(TJS-3000)說(shuō)明書(shū)具體操作提取。將干燥至恒重的杏鮑菇菌糠投入提取罐內(nèi)，加入料液比為1∶10蒸餾水，開(kāi)啟提取罐加熱系統(tǒng)，設(shè)置提取溫度100 ℃，使提取液加熱至沸騰30 min后，將提取液轉(zhuǎn)入濃縮罐。開(kāi)啟濃縮罐，設(shè)置濃縮溫度80 ℃，直至濃縮成需要的比重。再將濃縮液過(guò)濾后離心(1 000 r/min，5 min)，取上清液至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至體積的1/3，取濃縮液按照1∶3的比例加入95%乙醇。經(jīng)震蕩過(guò)夜，離心(3 500 r/min，15 min)，收集沉淀。加入Sevage試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1)混合搖勻震蕩過(guò)夜，離心取上清液，反復(fù)操作3次，取上清液經(jīng)真空干燥后得到粗多糖后備用。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：采用葡萄糖苯酚-硫酸測(cè)定多糖的含量。105 ℃干燥葡萄糖至恒重，精密稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g用蒸餾水溶解后定容至1 000 mL，得到100 mg/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，精密量取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1mL六個(gè)梯度分別置于試管中，加蒸餾水定容到1 mL，分別加1 mL苯酚(5%)，搖勻，加入5 mL濃硫酸，搖勻，60 ℃水浴，15 min，靜置10 min，在紫外分光光度計(jì)490 nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光度A值，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

1.2.3樣品含量的測(cè)定：分別精密稱(chēng)取杏鮑菇菌糠多糖0.1 g 3份分別置于3個(gè)試管中，加蒸餾水至10 mL，搖勻，精密量取0.1 mL多糖溶液加蒸餾水至10 mL，得到多糖濃度為0.1 mg/mL。精密吸取多糖溶液1 mL，分別加1 mL苯酚(5%)，搖勻，加入5 mL濃硫酸，搖勻，60 ℃水浴，15 min，靜置10 min，在紫外分光光度計(jì)490 nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光度。按照葡萄糖曲線求出多糖含量。

1.2.4杏鮑菇菌糠多糖飼料的制備：杏鮑菇菌糠多糖飼料的制備，委托福建省醫(yī)學(xué)研究所吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心制作，其中菌糠多糖按照占基礎(chǔ)飼料比例200 mg/kg、400 mg/kg及800 mg/kg制成低、中、高3種劑量組多糖飼料。

1.2.5小鼠分組及處理：48只KM小鼠適應(yīng)7 d后，隨機(jī)分為空白組、杏鮑菇菌糠多糖低劑量組、中劑量組和高劑量組4組，每組12只分兩籠飼養(yǎng)，每籠6只。其中空白組喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料，低劑量組、中劑量組、高劑量組分別喂養(yǎng)多糖濃度為200 mg/kg、400 mg/kg、800 mg/kg的多糖飼料。連續(xù)飼養(yǎng)60 d，小鼠自由采食及飲水。

1.2.6杏鮑菇菌糠多糖對(duì)小鼠免疫器官的影響：小鼠連續(xù)飼養(yǎng)60 d后，各組取6只小鼠空腹稱(chēng)重，脫頸椎處死小鼠取脾臟，稱(chēng)其質(zhì)量。按下式計(jì)算脾器官指數(shù)：

1.2.7杏鮑菇菌糠多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的測(cè)定[10-11]：各組取剩余的6只小鼠，2%戊巴比妥麻醉，心臟取血，置于EDTA-2 K抗凝管，離心(1 000 g，15 min)，分離血漿，-80 ℃保存?zhèn)溆?。無(wú)菌取脾臟，轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，加入PBS沖洗，剪碎脾臟，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中消化30 min，加入10% FBS完全培養(yǎng)液終止消化，在200目銅網(wǎng)上過(guò)濾，離心(1 000 r/min，5 min)，棄上清，加入1 mL紅細(xì)胞裂解液，常溫裂解 5 min，離心(1 000 r/min，5 min)，棄上清，加入PBS離心重復(fù)3次，棄上清，后加入10% FBS完全培養(yǎng)液。振蕩重懸后，將細(xì)胞與錐蟲(chóng)藍(lán)液混合后置于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，將計(jì)數(shù)好的細(xì)胞進(jìn)行濃度調(diào)整，統(tǒng)一調(diào)整至5.0×106個(gè)/mL。于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μL的脾淋巴細(xì)胞液，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。再加入150 μL ConA(終濃度為5 μg/mL)，并用含10% FBS完全培養(yǎng)液做空白對(duì)照。置于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，結(jié)束培養(yǎng)4 h前，每孔加入10 μL的CCK8，繼續(xù)溫育2 h，在光吸收酶標(biāo)儀上讀數(shù)，試驗(yàn)結(jié)果以A值表示。

1.2.8杏鮑菇菌糠多糖對(duì)小鼠免疫因子的影響：采集的血漿嚴(yán)格按照干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素(IL-6)試劑盒說(shuō)明書(shū)具體操作進(jìn)行測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 苯酚-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖1所示：制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為：y=5.403x+0.0784，R2=0.9992。橫坐標(biāo)表示濃度，縱坐標(biāo)表示吸光度。結(jié)果表明葡萄糖濃度在0～0.1 mg/mL范圍內(nèi)與吸收度呈良好的線性關(guān)系。

2.2 樣品含量測(cè)定

樣品含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。杏鮑菇菌糠多糖溶液測(cè)得的吸光度平均值代入回歸方程y=5.403x+0.0784，R2=0.9992，計(jì)算多糖的含量。結(jié)果得到杏鮑菇菌糠多糖的含量58.43%。表明利用超聲提取杏鮑菇菌糠的多糖含量高，菌糠具有開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of glucose

樣品sample123平均值average valueA值0.39220.39570.39430.3941含量/%58.0858.7358.4758.43

表2 杏鮑菇菌糠多糖對(duì)小鼠體質(zhì)量、脾質(zhì)量及脾指數(shù)的影響Table 2 Effect of pleurotus eryngii bacterial chaff polysaccharide on body weight,spleen weight and spleen index in mice

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01

Note：Compared with blank group，*P<0.05，**P<0.01

2.3 杏鮑菇菌糠多糖對(duì)小鼠體質(zhì)量、脾質(zhì)量及脾指數(shù)的影響

由表2可見(jiàn)，與空白組相比，杏鮑菇菌糠多糖的三個(gè)劑量組小鼠體質(zhì)量都有所增長(zhǎng)，但差異不顯著(P>0.05)；杏鮑菇菌糠多糖的中劑量組、高劑量組小鼠脾質(zhì)量顯著提高(P<0.05)；杏鮑菇菌糠多糖的低劑量組、中劑量組小鼠脾指數(shù)顯著提高(P<0.05)，高劑量組差異極顯著(P<0.01)。研究表明杏鮑菇菌糠多糖促進(jìn)小鼠脾質(zhì)量增長(zhǎng)、提高其脾指數(shù)。

2.4 杏鮑菇菌糠多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

由表3可見(jiàn)，與空白組相比，杏鮑菇菌糠多糖中劑量組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的A值顯著升高(P<0.05)，高劑量組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的A值極顯著升高(P<0.01)，低劑量組差異不顯著(P>0.05)。說(shuō)明杏鮑菇菌糠多糖有促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的作用。

2.5 杏鮑菇菌糠多糖對(duì)小鼠IFN-γ、TNF-α和IL-6含量的影響

由表4可見(jiàn)，與空白組相比，杏鮑菇菌糠多糖低劑量組小鼠IFN-γ、TNF-α和IL-6含量差異不顯著(P>0.05)；中劑量組小鼠TNF-α和IL-6含量顯著提高(P<0.05)；高劑量組小鼠IFN-γ含量顯著提高(P<0.05)，小鼠TNF-α和IL-6含量極顯著提高(P<0.01)。說(shuō)明杏鮑菇菌糠多糖對(duì)小鼠免疫因子IFN-γ、TNF-α和IL-6含量有一定促進(jìn)作用。

表3 杏鮑菇菌糠多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響Table 3 Effect of pleurotus eryngii bacterialchaff polysaccharide on proliferation of

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01

Note：Compared with blank group，*P<0.05，**P<0.01

表4 杏鮑菇菌糠多糖對(duì)小鼠IFN-γ、TNF-α和IL-6含量的的影響Table 4 Effect of pleurotus eryngii bacterial chaffpolysaccharide on IFN-γ, TNF-α and IL-6

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01

Note：Compared with blank group，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

機(jī)體的各種免疫功能之間存在著復(fù)雜的內(nèi)在聯(lián)系，相互調(diào)節(jié)并維持著免疫系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡。免疫器官、免疫細(xì)胞、免疫分子間平衡一旦被打破，則會(huì)出現(xiàn)免疫應(yīng)答異常，發(fā)生細(xì)胞因子失控性釋放，形成局部或全身病變。脾臟是免疫應(yīng)答的重要場(chǎng)所和重要調(diào)節(jié)器官，每個(gè)免疫細(xì)胞對(duì)免疫功能的影響都有其特定的生物學(xué)活性，當(dāng)機(jī)體受到抗原物質(zhì)刺激時(shí)，脾臟內(nèi)的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞能分裂增殖產(chǎn)生抗體或細(xì)胞因子。細(xì)胞因子在機(jī)體內(nèi)起到相互促進(jìn)或相互抑制的作用，它能夠調(diào)節(jié)全身系統(tǒng)免疫，是判斷機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)[12]。

食用菌多糖對(duì)免疫調(diào)節(jié)的研究日益增多，已證明很多真菌多糖能刺激免疫器官發(fā)育，提高脾指數(shù)，促進(jìn)機(jī)體非特異性免疫和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，提高血液循環(huán)中細(xì)胞因子含量，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[13-16]。其作用機(jī)制是通過(guò)促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，提高免疫器官發(fā)育或直接促進(jìn)細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的[17]。鄭素玲等[18]的研究表明，小鼠經(jīng)灌胃杏鮑菇多糖后的胸腺和脾臟指數(shù)得到明顯提高。李燕等[19]的研究表明，銀耳多糖具有提高衰老小鼠的免疫功能，促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖, 降低免疫衰老作用。閡靜等[20]研究表明，甘草多糖能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，促進(jìn)小鼠血清TNF-α、IL-2含量的提高，從而增強(qiáng)小鼠細(xì)胞免疫功能。陳丹丹等[21]發(fā)現(xiàn)肺氣虛證免疫低下可能是血清中IL-6、IFN-γ降低，而增加黃芪多糖可以提高血清的IL-6、IFN-γ水平，明顯改善機(jī)體免疫力。本文通過(guò)杏鮑菇菌糠中提取的多糖探討其對(duì)小鼠免疫功能的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，杏鮑菇菌糠多糖組與空白組相比，低劑量組顯著提高脾指數(shù)，中劑量組能顯著提高小鼠的脾質(zhì)量、脾指數(shù)，促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖(P<0.05)，同時(shí)能提高機(jī)體免疫因子IFN-γ、TNF-α及IL-6含量(P<0.05)；高劑量組能顯著提高小鼠的脾質(zhì)量、脾指數(shù)和IFN-γ含量(P<0.05)，極顯著促進(jìn)小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖，提高TNF-α及IL-6含量(P<0.01)。結(jié)果表明，多糖飼料可保證小鼠體質(zhì)量正常生長(zhǎng)，并增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞活性,促進(jìn)免疫器官增生和免疫因子分泌，具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能的作用。

綜上所述，杏鮑菇菌糠多糖能促進(jìn)小鼠免疫器官發(fā)育，顯著提高ConA誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖活性，促進(jìn)免疫細(xì)胞分泌免疫因子，提高免疫力，具有作為綠色飼料添加劑的潛在價(jià)值。