方 天 吳 迪 梁 磊 胡文娟 董 敏 許龍翔 惲時鋒

(1.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學科，南京 210002)(2.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院信息科，南京 210002)

數(shù)據(jù)顯示膀胱癌是男性中第六大癌癥[1]，雖然通過膀胱手術(shù)切除可以清除體內(nèi)癌細胞，但仍有一半膀胱切除術(shù)后病人仍在兩年內(nèi)復發(fā)[2]。此外，需要經(jīng)常進行跟蹤和監(jiān)測，以及手術(shù)后反復進行臨床干預和終身管理，使膀胱癌治療比其他任何癌癥花費更大[3]。通過酸堿水解柑橘果膠(Citruspectin,CP)可制得改性柑橘果膠(Modifiedcitruspectin,MCP)，果膠能防治腫瘤雖早為人知,但通常指能抑制結(jié)腸癌發(fā)生的不溶性膳食果膠。由于MCP比CP水溶性好,因而更易在體內(nèi)發(fā)揮作用[4]。MCP是一種具有抗癌活性的多糖[5],其靶點可能是半乳糖凝集素-3(Galectin-3,Gal-3)[6]。Galectin-3作為β-半乳糖苷結(jié)合蛋白家族的一員，是一種多功能蛋白；參與腫瘤細胞的生長，細胞分化，細胞黏附，細胞凋亡，惡性轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)移等過程[7]。值得一提的是，Galectin-3通過殺傷T細胞和干擾NK細胞功能來監(jiān)管腫瘤微環(huán)境[8]。Ahmed等正在提出治療癌癥另一可能的治療策略：即使用一些碳水化合物配體如MCP阻滯Galectin-3活性，從而達到對癌癥治療[9]。

Galectin-3在膀胱癌組織樣品中表達升高已有報道[10]。本課題旨在探討對膀胱癌移植瘤小鼠灌胃改良性柑橘果膠(MCP)，能夠抑制腫瘤的生長和增殖，MCP或許是治療膀胱癌的有效方法。本研究中體內(nèi)研究檢測了MCP對人膀胱癌細胞T24和J82細胞存活和細胞凋亡的影響；體外研究則檢測出MCP能顯著抑制T24移植瘤的生長。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人膀胱癌細胞系T24和J82來自中科院細胞庫(上海，中國)。細胞培養(yǎng)條件：培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基中(1640培養(yǎng)液+10%胎牛血清，pH 7.2)，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，每天更換培養(yǎng)液，細胞培養(yǎng)至80%～90%融合率，0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2 細胞增殖檢測

取處于對數(shù)生長期(匯度90%左右)的T24細胞和J82細胞，胰酶消化收集，96孔板接種細胞100 μL/孔，細胞數(shù)約3 000～5 000個/孔，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，加入不同濃度的MCP，根據(jù)預實驗結(jié)果，選取0.125、0.25、0.5、1.0和2.0% (mg/L)五個濃度組，空白對照組以培養(yǎng)液補足，每孔反應體系100 μL，每組5個復孔。取孵育72 h為檢測時間點。細胞增殖檢測操作步驟參照試劑盒說明書。按細胞增殖檢測試劑盒準備好細胞后，在自動酶標儀(型號：ELX800；Bio Tek公司)上測560 nm光密度A值(OD)，設對照組和完全空白組(只添加100 μL培養(yǎng)液)。用下列公式計算細胞增殖存活率：細胞存活率=實驗組A值/對照組A值×100%。

1.3 細胞凋亡蛋白檢測

分別收集濃度為0、0.5、1.0和2.0%的MCP處理48 h的T24和J82細胞，加裂解液，提取細胞總蛋白。BCA法進行蛋白質(zhì)定量。蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測前列腺蛋白質(zhì)的表達。具體方法：取 50 μg總蛋白樣品于10%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉后，一抗4 ℃孵育過夜。二抗室溫孵育40 min，顯色。β-actin作為一抗對照。光密度掃描半定量分析顯影條帶，目的條帶和β-actin信號面積之比評定其蛋白水平。

用于蛋白印跡中的一抗來源：cv Caspase-3和cv PARP購自Cell Signaling Technologies公司, 和 Galectin-3 購自Abcam公司，β-Actin購自Santa Cruz生物公司。

1.4 動物實驗

膀胱癌細胞株 T24 培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基中(1640培養(yǎng)液+10%胎牛血清，pH 7.2)，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，每天更換培養(yǎng)液，細胞培養(yǎng)至80%～90%融合率，0.25%胰蛋白酶消化傳代。接種于生長狀況良好的5～6周齡Balb/c裸小鼠背部皮下，每只裸鼠接種細胞106～107,共接種12只裸鼠。腫瘤長至長徑為0.5 cm左右大小時，分成3組，每組4只。改良柑橘果膠 (MCP，購自Eco Nugenics公司, 美國)溶于滅菌過的PBS。對照組每日灌胃PBS；MCP低劑量組按350 mg/kg·d-1進行灌胃；MCP高劑量組按700 mg/kg·d-1進行灌胃。三組裸鼠均灌胃6周。實驗整個過程皆在SPF級動物房內(nèi)完成。待移植腫瘤直徑1～2 cm時，脫頸處死荷瘤裸小鼠，取移植腫瘤塊放置4%甲醛溶液浸泡待用。

游標卡尺測量腫瘤長徑a與短徑b，按公式V=ab2/2來計算腫瘤體積。稱量腫瘤濕質(zhì)量和荷瘤裸鼠體質(zhì)量并進行統(tǒng)計分析。

1.5 免疫組化

常規(guī)免疫組化檢測腫瘤組織中Ki67 (1∶10 000, Vector Laboratories公司), cleaved Caspase-3 (1∶500, Cell Signaling Technologies公司), 和Galectin-3 (1∶100, Abcam公司)蛋白的表達，操作步驟：抗原修復，血清封閉；滴加一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜。滴加HRP(1∶200)山羊抗兔的IgG覆蓋于組織上。DAB顯色；復染細胞核；脫水封片，中性樹膠封片。顯微鏡鏡檢，圖像采集并進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

1.6 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 體外研究MCP對膀胱癌細胞增殖和凋亡的影響

濃度為0.125、0.25、0.5、1.0和2.0%的MCP處理人膀胱癌細胞株T24和J82，細胞增殖有顯著差異：對T24細胞活性有顯著抑制作用的最低濃度為0.125%；而對J82細胞活性有顯著抑制作用的最低濃度為0.5% (見圖1A和B,P<0.05)。

濃度為0、0.5、1.0和2.0% (質(zhì)量/體積) 的MCP分別處理人膀胱癌細胞株T24和J82 48 h后，細胞凋亡標志物Caspase-3和PARP的裂解產(chǎn)物表達變化：cv Caspase-3和cv PARP明顯增多(見圖1C)。

圖1 MCP對膀胱癌細胞T24和J82細胞增殖和凋亡的影響注：A，B.不同濃度MCP對T24和J82細胞存活率的影響； C. Western blotting檢測不同濃度MCP處理T24和J82細胞后，cleaved Caspase-3、cv Caspase-3和 Galectin-3蛋白表達量。** P<0.01; *** P<0.001Fig.1 Effects of MCP on cell proliferation apoptosis of T24 and J82 cellNote:A,B. Effects of MCP on cell viability by the SRB assay.C. Effects of MCP on cleaved Caspase-3、cv Caspase-3 and Galectin-3 proteins by Western blotting assay.** P<0.01; *** P<0.001

圖2 MC抑制T24癌細胞移植瘤大小注：A.各組腫瘤圖片；B.各組腫瘤濕重比較；C.各組腫瘤體積比較分析圖，高劑量組(700 mg/kg)與對照組相比，體積顯著減小(P<0.05)；D.實驗過程中，各組裸鼠體質(zhì)量沒有差異。** P<0.01Fig.2 MCP inhibited the growth of T24 xenograftsin vivoNote: MCP inhibited the growth of UBC xenograftsin vivo. Photograph (A) and the average weights (B) of T24 xenografts harvested at the endpoint. Tumor volume (C) and body weight (D) of T24 xenograft-bearing mice with MCP treatment for 6 weeks.Three experimental groups, including 700 mg/kg MCP, 350 mg/kg MCP and Vehicle control, were measured. ** P<0.01

2.2 MCP對T24移植瘤的抑制作用

不同劑量MCP溶液，即0、350和700 mg/kg對荷瘤裸鼠連續(xù)灌胃6周后，脫頸處死荷瘤裸鼠，取腫瘤，游標卡尺測量腫瘤長徑和短徑，稱量裸鼠體質(zhì)量和腫瘤組織濕重，并進行統(tǒng)計分析。結(jié)果如下：高劑量組(700 mg/kg)的腫瘤大小和質(zhì)量明顯小于對照組(P<0.05)。幾組裸鼠體質(zhì)量沒有差異，說明口服MCP對裸鼠沒有明顯副作用。

2.3 MCP對T24腫瘤組織增殖凋亡的影響

免疫組化實驗探討不同劑量MCP對T24移植瘤的腫瘤組織增殖凋亡以及潛在靶點Galectin-3的影響:腫瘤組織中，增殖標志物ki67和Galectin-3表達隨MCP濃度增高而降低，而凋亡標志物cv Caspase-3則隨濃度升高而升高(見圖3A)。進一步量化分析蛋白表達量：高劑量組增殖標志物ki67表達顯著降低(P<0.05，見圖3B)；低劑量組和高劑量組凋亡標志物cv Caspase-3表達量均顯著高于對照組(P<0.05，見圖3C)。

圖3 IHC檢測各組腫瘤組織中ki67、cv Caspase-3和 Galectin-3的表達量比較注：A.IHC染色各組腫瘤組織ki67、cv Caspase-3和 Galectin-3圖；B. 各組腫瘤組織Ki67陽性細胞數(shù)比較；C. 各組腫瘤組織cv Caspase-3陽性細胞數(shù)比較.*P<0.05;**P<0.01Fig.3 Expression of Ki67, cleaved Caspase-3 (cv Caspase-3) and Galectin-3 by IHCNote: A. Representative images of IHC staining for Ki67, cleaved Caspase-3 (cv Caspase-3) and Galectin-3 on tissue sections from MCP and vehicle-treated T24 xenografts. B.Proliferation index and apoptosis index were quantified by the positive IHC staining forKi67 and cleaved Caspase-3, respectively. Bars represented the mean ± SD.*P<0.05; **P<0.01

3 討論

本課題首次在體內(nèi)和體外研究中證明改良性柑橘果膠(MCP)，通過抑制膀胱癌細胞的增殖和誘導細胞凋亡來抑制腫瘤生長。MCP能降低潛在靶點Galectin-3的表達，而Galectin-3在膀胱癌樣品中表達過量且預示著較差的預后。作為一種可食用纖維，據(jù)報道來自不同植物的果膠均有抑制癌細胞作用[11]。例如，蘋果果膠能夠誘導人胸腺癌細胞MDA-MB-231體外凋亡，和誘導鼠胸腺癌細胞4T1體內(nèi)凋亡[12-13]。除了本課題證實的MCP能抑制膀胱癌細胞的增殖，誘導凋亡；MCP還能抑制前列腺癌和直腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[14-15]。MCP除了對腫瘤細胞有抑制作用，還能夠激活NK細胞對癌細胞的殺傷作用和對新生毛細血管的抑制作用[16]?？傊琈CP對兩種腫瘤細胞都有抑制作用，包括腫瘤微環(huán)境中的細胞。

MCP是一種水溶性柑橘衍生的多糖纖維，富含β-半乳糖殘基；MCP的細胞毒性作用是通過結(jié)合蛋白Galectin-3或下調(diào)Galectin-3[17-18]。Galectin-3是經(jīng)常在多種腫瘤細胞類型表達，并已知與細胞增殖、細胞生存、細胞黏附和轉(zhuǎn)移相關(guān)[19]?？傊?，我們的數(shù)據(jù)表明，MCP抑制人膀胱癌細胞體內(nèi)外增殖與存活。作為一種天然的膳食纖維，MCP是在人膀胱癌的化學預防和化療藥物的一個有吸引力的潛在藥物。MCP抑制人膀胱癌生長的具體機制和其他治療劑的聯(lián)合治療可在以后的研究中進一步探討。