（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018）

0 前言

12株植物乳桿菌為研究對(duì)象，采用雙層平板法對(duì)12株植物乳桿菌抗真菌特性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)，并對(duì)其無(wú)菌上清液在不同溫度和蛋白酶處理?xiàng)l件下的抑菌效果進(jìn)行了分析。

1 材料及方法

1.1 菌株及來(lái)源

實(shí)驗(yàn)中所用的12株植物乳桿菌保藏于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室乳酸菌菌種保藏庫(kù)(LABCC)，菌株及來(lái)源見表1。實(shí)驗(yàn)中采用的6株用于植物乳桿菌抑菌試驗(yàn)檢測(cè)的指示真菌的名稱及來(lái)源見表2。

1.2 實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基及試劑

1.2.1 培養(yǎng)基

乳酸菌活化及篩選培養(yǎng)基：MRS broth（OXOID，CM 0359）；MRSagar（OXOID，CM 0361）。

指示真菌培養(yǎng)基：Potato Dextrose Agar(PDA,Oxoid,CM 0139)。

1.2.2 試劑

PBS溶液，2 mol/L NaOH；胃蛋白酶，胰蛋白酶，蛋白酶K購(gòu)于大連寶生物工程有限公司。

表1 實(shí)驗(yàn)所用菌株及來(lái)源

表2 指示真菌

1.3 儀器與設(shè)備

冷凍離心機(jī)（5810R型，德國(guó)Eppendorf公司），臺(tái)式高速離心機(jī)（TGL-16B型，德國(guó)Eppendorf公司），全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器（HA-300M，日本Hirayama公司），恒溫水浴鍋（HWS28型，上海一恒科技有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9272型，上海一恒科技有限公司）BCD-245D型冰箱（青島海爾股份有限公司），12001型電子天平（上海天平儀器廠），HPS-250型生化培養(yǎng)箱（哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠制造）；雷磁PHS-3C pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 抑真菌植物乳桿菌的篩選

采用雙層平板法[8]（di-layer medium method）對(duì)菌株進(jìn)行篩選，固體MRS作為下層培養(yǎng)基，待其凝固后，滴入3μL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的植物乳桿菌發(fā)酵液，于37℃培養(yǎng)24 h，每株菌做3個(gè)平行。真菌發(fā)酵液（106CFU/mL，OD 600=0.5）與半固體PDA培養(yǎng)基（瓊脂0.75%）混合后，作為上層培養(yǎng)基。24℃好氧條件下培養(yǎng)5 d，觀察抑菌圈大小，結(jié)果取平均值，分別以（-）（無(wú)抑制作用）；（+/-）（直徑＜1 mm）；（+）（直徑1-3 mm）；（++）（直徑＞3 mm）表示。

1.4.2 發(fā)酵上清液抑菌活性的測(cè)定

測(cè)定植物乳桿菌發(fā)酵上清液的抑菌活性時(shí)，采用瓊脂孔擴(kuò)散法[9]（Well-diffiision Agar Assay）。以真菌作為指示菌，在含有真菌孢子懸液的固體培養(yǎng)基上打孔，每孔中加入100μL植物乳桿菌無(wú)菌上清液，于4℃冰箱中擴(kuò)散2 h后置于24℃恒溫培養(yǎng)3～5 d。當(dāng)空白對(duì)照平板長(zhǎng)滿真菌時(shí)，測(cè)量各樣品抑菌圈的大?。ūＡ魞晌挥行?shù)字）。

1.4.3 植物乳桿菌無(wú)細(xì)胞上清液抑菌活性的測(cè)定

將菌株于37℃培養(yǎng)18 h后離心（8 000 g，20 min，4℃），上清液過(guò)濾（0.22μm）。將過(guò)濾后的無(wú)菌上清液置于-80℃10 min，取一部分無(wú)菌上清液進(jìn)行如下處理：用2 mol/L NaOH中和菌液至p H=6.5。接下來(lái)，對(duì)每種中和的上清液進(jìn)行如下酶促和熱處理，分別加入胃蛋白酶（1 mg/mL），胰蛋白酶（1 mg/mL）和蛋白酶K（1 mg/mL），37℃敷育1 h，未進(jìn)行酶促處理的p H=6.5的無(wú)菌上清液為空白對(duì)照[10]。

另一部分無(wú)菌上清液用于溫度處理：在80℃敷育1 h，100℃敷育1 h，以未作任何處理的植物乳桿菌無(wú)菌上清液為空白對(duì)照[11]。

以上實(shí)驗(yàn)均運(yùn)用瓊脂孔擴(kuò)散法來(lái)測(cè)定菌株對(duì)真菌的抑菌活性。抑菌圈大小分別以（-）、（+/-）、（+）和（++）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗真菌植物乳桿菌的篩選

以6株真菌為指示菌，采用雙層平板法由12株植物乳桿菌中篩選出對(duì)指示真菌抑菌效果較好的菌株，結(jié)果取平均值。結(jié)果顯示，92%的受試菌株對(duì)擴(kuò)展青霉有較強(qiáng)抑制作用，超過(guò)一半的菌株對(duì)黃曲霉、串珠鐮刀菌、產(chǎn)黃青霉、芽枝狀枝孢具有抑菌效果，僅有IMAU 40082和IMAU 60047對(duì)黑曲霉產(chǎn)生微量抑菌作用。具體結(jié)果如下（表3，圖1）。

表3 12株植物乳桿菌對(duì)指示真菌的抑制結(jié)果

2.2 植物乳桿菌發(fā)酵上清液抑菌活性的測(cè)定

為了表征植物乳桿菌的抗真菌活性化合物，通過(guò)瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)一步研究植物乳桿菌IMAU80095無(wú)菌上清液（CFS）的抑菌活性。將CFS進(jìn)行物理和化學(xué)處理，以排除或證實(shí)其抗真菌物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)。

圖1 IMAU80095對(duì)6株真菌的抑菌效果

結(jié)果顯示，胰蛋白酶處理后的無(wú)菌上清液與未處理的上清液的抑制能力存在一定差異。經(jīng)過(guò)胰蛋白酶處理的CFS對(duì)黃曲霉、串珠鐮刀菌、擴(kuò)展青霉、產(chǎn)黃青霉和芽枝狀枝孢具有較小的抑制作用（＜1mm），對(duì)黑曲霉則表現(xiàn)為無(wú)抑制作用。然而，經(jīng)過(guò)胃蛋白酶和蛋白酶K處理的CFS與未處理的上清液的抑制能力完全相同，對(duì)6株真菌并無(wú)抑制。同樣，熱處理對(duì)抑制生長(zhǎng)具有影響，高溫處理后的CFS（80℃，1 h和100℃，1 h）完全喪失抑菌作用，未作處理的無(wú)菌上清液明顯有抑菌圈。實(shí)驗(yàn)還證明，該化合物對(duì)p H的變化較敏感，無(wú)菌上清液在未調(diào)pH（酸性pH）下顯示出明顯的抗真菌活性，在將pH調(diào)至6.5時(shí)，抑菌活性降低，喪失了其拮抗性質(zhì)。

表4 IMAU80095發(fā)酵上清液抑制6種真菌活性結(jié)果

3 討論

絲狀真菌是廣泛存在的食品腐敗微生物，其在食品工業(yè)中造成重大經(jīng)濟(jì)損失，并且由于其潛在的產(chǎn)霉菌毒素的能力而與食品安全問(wèn)題有關(guān)[12,13]。在過(guò)去的幾年中，人們開始廣泛地研究乳酸菌的抗真菌特性，乳酸菌也被添加到了食品中作為生物防腐劑使用[14]，這一措施有效的避免了由于物理防腐和化學(xué)防腐而帶來(lái)的不利影響。研究表明，植物乳桿菌已成為乳桿菌屬中抗真菌領(lǐng)域的重要參與者[15]，對(duì)多種真菌均具有抑制作用。

本研究中選用的12株植物乳桿菌分離自內(nèi)蒙古、青海省、四川省等5個(gè)地區(qū)，分離于發(fā)酵乳、泡菜、曲拉等發(fā)酵制品中；6株指示真菌也均分離于燕麥、水果、干酪等食品中。研究中的每株植物乳桿菌對(duì)于指示真菌表現(xiàn)出較大的差異，其中，植物乳桿菌能夠較大程度的抑制串珠鐮刀菌、擴(kuò)展青霉、產(chǎn)黃青霉和芽枝狀枝孢，而對(duì)黑曲霉幾乎無(wú)抑制作用。在Cheong的研究中，有12株植物乳桿菌對(duì)曲霉屬、青霉屬和枝孢菌屬的物種顯示出抗真菌活性[16]。Magnusson等[17]報(bào)道了類似的結(jié)果，他分析了1 200株乳酸菌，發(fā)現(xiàn)了幾株植物乳桿菌對(duì)曲霉菌，青霉菌和鐮刀菌屬具有強(qiáng)抑制活性，但對(duì)P.roqueforti不起作用。最近，Crowley等人[18]對(duì)約7 000株乳酸菌進(jìn)行的大規(guī)模篩選表明，大多數(shù)植物乳桿菌能夠抑制擴(kuò)展青霉的生長(zhǎng)。以上研究結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果較為吻合。

乳酸菌抗菌活性一般直接通過(guò)含活細(xì)胞的菌液來(lái)表達(dá)，或者由于生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的各種活性拮抗代謝物而間接表達(dá)。因此，植物乳桿菌分離物含活細(xì)胞的菌液表現(xiàn)出廣泛的抗真菌活性譜。進(jìn)一步研究中，采用瓊脂擴(kuò)散法將CFS加入PDA平板中，是建立乳酸菌CFS抗真菌活性的快速方法。植物乳桿菌對(duì)真菌的抑制活性在不同的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)，并且由不同的因素引起。早期階段的抑菌活性是在發(fā)酵過(guò)程中實(shí)現(xiàn)的，是由于菌株在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物而產(chǎn)生抑菌效果。研究者將植物乳桿菌的抗真菌化合物純化，分離出的這些物質(zhì)有苯乳酸、蛋白質(zhì)和脂肪酸等。晚期階段，在細(xì)胞生長(zhǎng)結(jié)束時(shí)發(fā)現(xiàn)，肽化合物的釋放也可能對(duì)真菌產(chǎn)生抑制作用，因?yàn)榧?xì)胞自溶是所有菌株常見的特征。

在研究植物乳桿菌IMAU 80095的活性抗真菌化合物時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)胰蛋白酶處理的CFS對(duì)黃曲霉、串珠鐮刀菌、擴(kuò)展青霉、產(chǎn)黃青霉和芽枝狀枝孢具有較小的抑制作用（＜1 mm），對(duì)黑曲霉則無(wú)抑制。胃蛋白酶和蛋白酶K處理的CFS對(duì)6株真菌并無(wú)抑制，與未處理的上清液的抑制能力完全相同。目前，有很多研究發(fā)現(xiàn)了對(duì)真菌和酵母具有抑制作用的蛋白類物質(zhì)，它們的數(shù)量遠(yuǎn)低于對(duì)細(xì)菌有抑制作用的蛋白類物質(zhì)，如各種細(xì)菌素等[19]。最初的研究發(fā)現(xiàn)，利用蛋白酶對(duì)乳酸菌發(fā)酵上清液進(jìn)行處理會(huì)造成抑真菌特性的損失，后來(lái)通過(guò)進(jìn)一步研究更加深入的了解了這些蛋白質(zhì)的特性[20]。這一結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)接近。同樣，熱處理對(duì)植物乳桿菌上清液抑制真菌生長(zhǎng)具有影響，本實(shí)驗(yàn)中，高溫處理過(guò)的CFS完全喪失抑菌作用，未作處理的無(wú)菌上清液明顯有抑菌圈。熱處理可能會(huì)對(duì)上清液的抑菌物質(zhì)造成影響進(jìn)而引起菌株抑菌能力的丟失。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，IMAU80095的活性抗真菌化合物對(duì)pH的變化較敏感，將pH調(diào)至6.5時(shí)，抑菌活性明顯降低，證明其抑制能力可能與低p H的有機(jī)酸相關(guān)，這些有機(jī)酸可能為苯乳酸、乳酸、醋酸等。

目前的研究由于缺乏分離少量活性代謝物的合適測(cè)定方法，大多數(shù)化合物仍待鑒定。因此，進(jìn)一步的研究應(yīng)致力于發(fā)展有效的方法檢測(cè)抗真菌代謝物的復(fù)雜生物系統(tǒng)，控制抗真菌化合物的最佳條件，以使其更好的抑制真菌，保證食品的安全性。