顧清，張莉，張新星，代小松，陳和平

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，成都610072)

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，每年死亡病例數(shù)約68萬，其中約50萬在中國[1]。多數(shù)胃癌患者就診時已處于中晚期，以手術(shù)切除為基礎(chǔ)并輔助放化療的綜合治療方案是目前主要的臨床治療策略，然而放化療耐藥、對其他組織器官的侵襲等嚴重制約了胃癌患者的治療效果，胃癌患者的預(yù)后不佳，臨床亟需尋找新的與胃癌治療相關(guān)的生物靶分子[2]。Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子(KLF)可與富含GC序列的啟動子區(qū)結(jié)合，調(diào)節(jié)基因表達。KLF在各種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用，如血管形成[3]、腫瘤形成[4,5]等。研究證實，KLF2可通過上調(diào)p15和p21基因表達，抑制腫瘤增殖[6]。KLF16是Kaczynski等[7]在2002年鑒定的一個新的KLF家族成員，可抑制胰腺癌細胞增殖，而關(guān)于KLF16在胃癌中的表達文獻報道甚少。2016年1月～2017年10月，我們檢測了KLF16在人胃癌細胞中的表達，并探討了其對胃癌細胞增殖、克隆能力的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃上皮細胞株GES-1、人胃癌細胞株BGC-823、SGC7901、HCG-27和AGS(中國科學(xué)院上海細胞庫)，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和雙抗(美國Gibco公司)，免疫組化試劑盒(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司)，兔抗人KLF16多克隆抗體(ab187973,IHC-P，美國Abcam公司)，RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)，Real-time PCR引物序列(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，脂質(zhì)體Lipofectamine 3000(美國Invitrogen公司)，shRNA(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，CCK-8溶液(上海翊圣生物科技有限公司)，低熔點瓊脂糖(北京凱瑞基生物科技有限公司)，RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒和ECL發(fā)光液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，兔抗人KLF16多克隆抗體(ab175892，美國Abcam公司)，兔抗人p21單克隆抗體(ab109520，美國Abcam公司)，兔抗人周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)單克隆抗體(ab108357，美國Abcam公司)，兔抗人GAPDH多克隆抗體(ab9485，美國Abcam公司)，HRP標記的羊抗兔二抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。紫外分光光度計(ND-2000，美國Thermo公司)，熒光定量PCR儀(7600，美國ABI公司)，酶標儀(ELX800，美國伯騰儀器有限公司)，凝膠成像儀(2500R，上海天能科技有限公司)。

1.2 細胞培養(yǎng) 取人胃上皮細胞株GES-1及人胃癌細胞株BGC-823、SGC7901、HCG-27、AGS，均培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基(含雙抗+10% FBS)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，取復(fù)蘇后第4～10代細胞進行試驗。

1.3 細胞中KLF16 mRNA相對表達量檢測 取約5×104個處于對數(shù)生長期的BGC-823和SGC-7901細胞，每種細胞分為3組，接種于6孔板中，24 h后，sh-KLF16 1#、2#、3#組采用脂質(zhì)體Lipofectamine 3000，分別將sh-KLF16 1#(5′-AGC GCT TCA CCC GCA GTG A-3′)、sh-KLF16 2#(5′-GTG CTC ATG GCC ATC TCT T-3′)、sh-KLF16 3#(5′-CGC ACC TAA AGT CGC ACCT-3′)轉(zhuǎn)染至細胞中，sh-NC組將shRNA無關(guān)序列轉(zhuǎn)染至細胞中，以不轉(zhuǎn)染shRNA的細胞為空白對照組。操作步驟參照試劑說明書。轉(zhuǎn)染后12 h，Real-time PCR法檢測KLF16 mRNA相對表達量。試驗重復(fù)3次?；虮磉_量以2-ΔΔCt法計算。

1.4 細胞增殖活性檢測 采用CCK-8法。將轉(zhuǎn)染后的細胞懸液，接種至96孔板中，接種密度約8 000/孔，每組設(shè)置3個復(fù)孔，24、48和72 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，在酶標儀450 nm波長處測定吸光度值，計算3個復(fù)孔的平均值。試驗重復(fù)3次后，進行統(tǒng)計分析。

1.5 細胞克隆數(shù)目測算 制備1.2%和0.7%低熔點瓊脂糖溶液，高壓滅菌后，置于40 ℃水??；按1∶1比例，制備1.2%低熔點瓊脂糖溶液和2×RPMI 1640培養(yǎng)基(2×雙抗和20%FBS)的混合液，取混合液2 mL至6孔板中，冷卻凝固備用；取轉(zhuǎn)染后的單細胞懸液，細胞計數(shù)后，調(diào)整細胞密度為1×106/L；按1∶1比例，制備0.7%低熔點瓊脂糖溶液和2×RPMI 1640培養(yǎng)基(含20% FBS和2×雙抗)的混合液，再加入細胞懸液200 μL，充分混勻，取適量(約500個細胞)加入至上述6孔板中，形成雙層瓊脂層，凝固后，置于培養(yǎng)箱中10～14 d，觀察并記錄細胞克隆數(shù)目。試驗重復(fù)3次后，進行統(tǒng)計分析。

1.6 細胞中KLF16、p21和CDK4蛋白表達檢測 采用Western blotting法。收集各組細胞約1×106個，加入RIPA蛋白裂解液150 μL，充分裂解后，提取細胞全蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。SDS-PAGE膠電泳分離蛋白后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫振蕩封閉30 min，TBS-T溶液洗滌1次，分別加入兔抗人KLF16多克隆抗體，兔抗人p21單克隆抗體，兔抗人CDK4單克隆抗體，兔抗人GAPDH多克隆抗體室溫孵育1 h。TBS-T溶液洗滌3次，分別加入HRP標記的羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，TBS-T溶液洗滌3次，ECL發(fā)光液進行化學(xué)發(fā)光顯影，凝膠成像儀對蛋白條帶進行觀察，獲取圖像，采用Image Lab軟件對圖像進行灰度分析，計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值。試驗重復(fù)3次后，進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 各組KLF16 mRNA相對表達量比較 BGC-823細胞中，空白對照組，sh-NC組，sh-KLF16 1#、2#、3#組KLF16 mRNA相對表達量分別為1.13±0.10、1.06±0.15、0.57±0.11、0.72±0.14、0.39±0.13，SGC-7901細胞中，空白對照組，sh-NC組，sh-KLF16 1#、2#、3#組KLF16 mRNA相對表達量分別為1.09±0.12、1.02±0.14、0.59±0.15、0.53±0.11、0.31±0.15；兩種細胞中，sh-KLF16 #3組的KLF16 mRNA相對表達量低于sh-KLF16 #1組和sh-KLF16 #2組(P均<0.05)。

2.2 各組細胞增殖活性比較 在BGC-823和SGC-7901細胞中，與空白對照組和sh-NC組相比，sh-KLF16 3#組轉(zhuǎn)染48、72 h細胞增殖活性低(P均<0.05)。見表1。

表1 各組轉(zhuǎn)染24、48、72 h后細胞增殖活性比較

注：與同時點空白對照組和sh-NC組相比，*P<0.05。

2.3 各組細胞克隆數(shù)目比較 BGC-823細胞中，空白對照組、sh-NC組、sh-KLF16 3#組細胞克隆數(shù)目分別為(180.45±19.32)、(189.83±22.43)、(109.32±24.31)個；SGC-7901細胞中，空白對照組、sh-NC組、sh-KLF16 3#組細胞克隆數(shù)目分別為(148.41±21.43)、(152.95±24.75)、(87.82±18.43)個；sh-KLF16 3#組細胞克隆數(shù)目低于空白對照組、sh-NC組(P均<0.05)。見圖1。

圖1 平板克隆形成試驗檢測各組細胞克隆形成能力(×200)

2.4 各組細胞中KLF16、p21和CDK4蛋白表達比較 BGC-823細胞中，空白對照組KLF16、p21、CDK4蛋白相對表達量分別為1.13±0.10、0.84±0.12、1.21±0.18，sh-NC組分別為1.15±0.12、0.79±0.15、1.36±0.32，sh-KLF16 3#組分別為0.21±0.03、1.34±0.21、0.31±0.11。SGC-7901細胞中，空白對照組KLF16、p21、CDK4蛋白相對表達量分別為1.02±0.09、0.78±0.11、1.13±0.08，sh-NC組分別為1.09±0.13、0.69±0.22、1.09±0.14，sh-KLF16 3#組分別為0.26±0.07、1.38±0.28、0.42±0.08。在BGC-823和SGC-7901細胞中，干擾KLF16基因表達后，p21蛋白表達增加，而CDK4蛋白表達下降(P均<0.05)。

3 討論

胃癌是最常見的胃腸道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于肺癌[8]。手術(shù)切除可有效改善胃癌患者的預(yù)后，但患者的5年總生存率僅29%左右。目前已有多個靶向治療藥物進入臨床試驗階段，但效果并不理想[9,10]，臨床仍亟需尋找能有效靶向治療胃癌的生物靶標。

KLF是真核細胞中一類含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，以細胞周期和啟動子依賴性的方式參與調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。KLF在腫瘤形成和惡性進展中發(fā)揮多種功能，如KLF2通過調(diào)節(jié)p15和p21表達，在肺癌中發(fā)揮抑癌基因功能[6]；KLF4可抑制胰腺癌[11]、胃癌[12]和結(jié)腸癌[13]等腫瘤細胞增殖。此外，KLF15被證實在乳腺癌等多種腫瘤細胞中發(fā)揮抑癌基因功能[14]。目前，關(guān)于KLF16的研究主要集中于代謝和內(nèi)分泌方面[15]，在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中，KLF16可抑制神經(jīng)突起生長，導(dǎo)致軸突冠萎縮[16]；此外，KLF16可減少PPARγ表達進而抑制脂肪生成[17]，而在KRAS癌基因突變的腫瘤細胞中，KLF16可抑制細胞增殖[18]。

本研究結(jié)果顯示，在BGC-823和SGC-7901細胞中干擾KLF16基因表達后，細胞的增殖和克隆形成能力被顯著抑制，鑒于現(xiàn)有的文獻報道，推測KLF16可能參與了細胞周期調(diào)節(jié)。研究證實，p21蛋白通過其N末端特異性地與PCNA、Cyclin-CDK結(jié)合，抑制CDK活性，阻滯細胞周期，進而抑制細胞增殖；CDK4蛋白正向調(diào)控細胞周期，促進細胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化，CDK4高表達促進多種腫瘤的惡性進展[18]。本研究中，Western blotting試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾BGC-823和SGC-7901細胞中KLF16基因表達，可顯著增加p21蛋白表達，同時降低CDK4蛋白表達，提示KLF16表達下降，可能導(dǎo)致了細胞周期阻滯，進而抑制了細胞增殖。

綜上所述，干擾KLF16基因表達，可抑制細胞增殖和克隆形成能力。KLF16發(fā)揮癌基因的功能可能是通過上調(diào)CDK4和下調(diào)p21表達，導(dǎo)致細胞周期阻滯實現(xiàn)。KLF16可作為胃癌患者治療和預(yù)后預(yù)測的生物靶標，后續(xù)研究將繼續(xù)探討KLF16對細胞周期調(diào)節(jié)的具體內(nèi)在機制。