宋光澤 趙慧霞

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是兒童和青少年中最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性骨腫瘤[1]。研究證明許多miRNA在骨肉瘤中的抗轉(zhuǎn)移作用[2]。hsa-miR-34(miR-34)家族成員是腫瘤抑制蛋白p53的直接轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡和細(xì)胞周期阻滯在幾種類型的癌癥中起抑制腫瘤的作用[3]。細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶4(CDK4)是TargetScan預(yù)測(cè)的miR-34b靶基因之一。CDK4是蛋白激酶復(fù)合物的催化亞基，對(duì)于細(xì)胞周期G1期進(jìn)展十分重要。然而，關(guān)于在骨肉瘤患者中miR-34b對(duì)CDK4的調(diào)控作用及相關(guān)臨床意義尚未研究。本研究旨在探究hsa-miR-34b-3p(miR-34b)與CDK4在骨肉瘤中表達(dá)水平及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 患者資料及樣本收集

選取我院2012年3月至2016年3月病理科骨肉瘤患者外檢檔案中100例凍存骨肉瘤組織及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本，其中男性與女性病例各50例，年齡8～70歲，平均(17±7)歲，病程1～24個(gè)月，平均(5±1.5)個(gè)月。其中軟組織浸潤(rùn)67例，軟組織無(wú)浸潤(rùn)33例，腫瘤轉(zhuǎn)移58例，無(wú)轉(zhuǎn)移42例。Enneking外科診斷分期：Ⅰ期病例21例，Ⅱa期病例24例，Ⅱb期病例26例，Ⅲ期病例29例。

1.2 方法

1.2.1 MicroRNA、mRNA提取及熒光定量實(shí)時(shí)PCR(Quantitative realtime-PCR，qRT-PCR) 使用qRT-PCR檢測(cè)組織中hsa-miR-miR-34b-3p(miR-34b)表達(dá)水平。使用TRIzol試劑(Invitrogen)從組織提取總RNA。使用Reverse Transcription Kit(Takara)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Green(Takara)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR分析。利用ABI7500系統(tǒng)(Applied Biosystems)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。以U6作為內(nèi)參。用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR反應(yīng)條件: 95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.2 蛋白免疫印跡(Western Blot，WB)分析 使用WB檢測(cè)CDK4蛋白的表達(dá)水平。使用RIPA蛋白提取試劑(Beyotime)裂解組織，從組織中提取蛋白質(zhì)。在4 ℃下12 000×g離心10 min后，通過(guò)10%SDS-PAGE分離上清液，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(Sigma)上。將膜在PBS和5%脫脂乳中封閉1 h，并用針對(duì)CDK4的一抗(cell signaling technology)將膜在4 ℃孵育過(guò)夜。將膜用HRP綴合的二抗(cell signaling technology)在室溫下孵育1 h。β-actin蛋白表達(dá)作為內(nèi)參。使用Quantity One軟件(life technologies)評(píng)估相對(duì)蛋白表達(dá)水平。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-34b和CDK4蛋白在骨肉瘤組織樣本及癌旁非腫瘤組織中的表達(dá)情況

與癌旁非腫瘤組織相比，骨肉瘤組織中miR-34b的表達(dá)水平顯著降低，而CDK4蛋白的表達(dá)水平顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 骨肉瘤組織樣本及癌旁非腫瘤組織中miR-34b和CDK4蛋白的表達(dá)情況

注：與非腫瘤組織相比，*為P<0.05。

2.2 miR-34b和CDK4 蛋白在骨肉瘤組織樣本中的表達(dá)情況及相關(guān)性分析

在骨肉瘤患者的組織樣本中檢測(cè)到miR-34b和CDK4蛋白的表達(dá)，如圖1所示。在骨肉瘤組織中，miR-34b的表達(dá)隨腫瘤臨床分期進(jìn)展而逐漸降低(圖1A)，而CDK4蛋白的表達(dá)逐漸增高(圖1B)。通過(guò)分析骨肉瘤組織中miR-34b表達(dá)變化與CDK4 蛋白表達(dá)變化的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著miR-34b表達(dá)水平的降低，CDK4 蛋白表達(dá)呈上升趨勢(shì)，miR-34b表達(dá)與CDK4 蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，見(jiàn)圖1C。

圖1 miR-34b和CDK4 蛋白在骨肉瘤組織樣本中的表達(dá)及相關(guān)性分析

2.3 骨肉癌組織中miR-34b、CDK4蛋白表達(dá)與臨床分期的關(guān)系

在骨肉瘤不同臨床分期中，miR-34b和CDK4蛋白表達(dá)水平不同(P均<0.05)。隨著臨床分期的進(jìn)展，miR-34b表達(dá)呈上升趨勢(shì)，而CDK4 蛋白表達(dá)呈下降趨勢(shì)，見(jiàn)表2。

表2 骨肉癌組織中miR-34b和CDK4蛋白表達(dá)與臨床分期的關(guān)系

注：與Ⅰ期相比，①為P<0.05；與Ⅱa期相比，②為P<0.05；與Ⅱb期相比，③為P<0.05。

2.4 骨肉癌組織中miR-34b和CDK4蛋白表達(dá)與臨床指標(biāo)的關(guān)系

在軟組織浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移病例中miR-34b的表達(dá)水平，顯著低于軟組織無(wú)浸潤(rùn)和無(wú)轉(zhuǎn)移病例，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而CDK4蛋白表達(dá)顯著增高(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 骨肉癌組織中miR-34b和CDK4蛋白表達(dá)與臨床指標(biāo)的關(guān)系

注：與無(wú)浸潤(rùn)組相比，*為P<0.05；與無(wú)轉(zhuǎn)移組相比，#為P<0.05。

3 討論

骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程與多種致癌基因及抑癌基因的表達(dá)相關(guān)。致癌基因和抑制基因表達(dá)異常通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。

MiRNA是長(zhǎng)21-25nt的非編碼RNA分子，其通過(guò)靶向結(jié)合mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)來(lái)抑制轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)。MiRNA可結(jié)合mRNA的部分互補(bǔ)識(shí)別序列，隨后引起mRNA降解可翻譯抑制，從而有效沉默其靶基因[4-6]。生物信息學(xué)研究表明，三分之一的已知基因可能被miRNA調(diào)控。許多研究已報(bào)道m(xù)iRNA參與許多重要的細(xì)胞過(guò)程，如細(xì)胞凋亡、分化、增殖、腫瘤發(fā)生及抑制等[7]。證據(jù)表明，miRNA突變或表達(dá)異常與各種人類癌癥相關(guān)。miRNA通過(guò)調(diào)節(jié)其他腫瘤抑制因子或致癌基因表達(dá)而起癌基因或抑癌基因的作用[8]。在癌癥中，miRNA調(diào)節(jié)異常是影響下游靶點(diǎn)，并進(jìn)一步影響致瘤性發(fā)生如增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡的常見(jiàn)特征[9]。因此，miRNA在腫瘤組織中的表達(dá)可作為診斷和預(yù)后評(píng)估的新靶點(diǎn)。

MiR34家族由位于染色體1(miR-34a)和染色體11(miR-34b/c)的3個(gè)同源miRNA組成，神經(jīng)母細(xì)胞瘤、乳腺癌、前列腺癌和肺癌中檢測(cè)到miR34的缺失。miR-34家族成員由p53在DNA損傷或致癌應(yīng)激反應(yīng)中直接誘導(dǎo)而表達(dá)[10]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-34在許多惡性腫瘤中表達(dá)降低，如前列腺癌中的miR-34c、結(jié)腸癌和肺癌中的miR-34a和-34c、神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的miR-34a、乳腺癌中的miR-34a和-34b[11-14]。miR34a通過(guò)抑制CD44蛋白的表達(dá)來(lái)抑制骨肉瘤細(xì)胞在體內(nèi)和體外的轉(zhuǎn)移[15]。miR34c通過(guò)靶向調(diào)控Notch1和LEF1而抑制骨肉瘤細(xì)胞遷移，且miR34c表達(dá)的增加對(duì)克服骨肉瘤細(xì)胞化療耐藥性具有重要意義[16]。miR34b與三陰性乳腺癌(TNBC)患者的生存率呈負(fù)相關(guān)，可作為T(mén)NBC的預(yù)后生物標(biāo)志物[17]。在骨肉瘤細(xì)胞系中，miR-34s影響CDK6、E2F3、Bcl-2的表達(dá)，并以p53依賴的方式部分誘導(dǎo)G1期停滯和細(xì)胞凋亡，且在骨肉瘤組織樣本中檢測(cè)到miR-34s表達(dá)的降低[18]。miR-34在癌癥中的表達(dá)下調(diào)表明miR-34家族作為腫瘤抑制基因，可作為癌癥預(yù)后潛在標(biāo)志物。然而，miR-34b在骨肉瘤中的表達(dá)情況與骨肉瘤臨床病理特征之間關(guān)系的研究鮮有報(bào)道。本研究采用qRT-PCR技術(shù)分析了100例骨肉瘤組織中miR-34b的表達(dá)情況，并分析其臨床意義。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-34b在骨肉瘤組織中的表達(dá)顯著低于癌旁非腫瘤組織，且隨著臨床分期的進(jìn)展，其表達(dá)逐漸降低，且在軟組織浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移病例中，miR-34b的表達(dá)顯著下降。提示，miR-34b表達(dá)異常與骨肉瘤病情進(jìn)展密切相關(guān)。

細(xì)胞周期調(diào)控異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。CDK4是與細(xì)胞周期調(diào)控過(guò)程G1/S期密切相關(guān)的基因，推動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)程。CDK4及其調(diào)節(jié)亞基cyclinD1是致癌基因，研究顯示，這兩種基因在多種常見(jiàn)人類癌癥中表現(xiàn)出異常擴(kuò)增[19]。此外cyclinD1-CDK4復(fù)合物的形成及激活是幾種腫瘤類型形成所必需的,其中CDK4亞基催化功能至關(guān)重要[20]。CDK4過(guò)度活化是人類癌癥的常見(jiàn)標(biāo)志[21]。本研究中發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組織中CDK4蛋白表達(dá)顯著增加，且隨著臨床分期的進(jìn)展逐漸增加，在軟組織浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移病例中的表達(dá)也顯著增加。

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，CDK4受到多種miRNA的調(diào)節(jié)，而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。研究表明，在膀胱癌細(xì)胞系中，miR-124直接靶向調(diào)控CDK4的表達(dá)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[22]。MiR-613通過(guò)靶向CDK4誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯而抑制小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的活性及腫瘤形成[23]。CDK4是TargetScan預(yù)測(cè)的miR-34b靶基因之一。miR-34b對(duì)CDK4的調(diào)控作用在骨肉瘤中的研究及相關(guān)臨床意義尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究中，通過(guò)分析骨肉瘤組織中miR-34b表達(dá)變化與CDK4 蛋白表達(dá)變化的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，隨著miR-34b表達(dá)的降低，CDK4 蛋白表達(dá)呈上升趨勢(shì)，即miR-34b表達(dá)與CDK4 蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示，在骨肉瘤中，miR-34b至少部分通過(guò)影響CDK4 蛋白表達(dá)而在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展及病情演變過(guò)程中起作用。

綜上所述，在骨肉瘤組織中，miR-34b的表達(dá)隨臨床分期進(jìn)展而逐漸降低，而CDK4蛋白的表達(dá)逐漸增加，miR-34b表達(dá)與CDK4 蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)miR-34b與CDK4是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要分子機(jī)制。然而關(guān)于miR-34b對(duì)CDK4調(diào)控相關(guān)的分子機(jī)制，及其與骨肉瘤不良預(yù)后的關(guān)系，還需進(jìn)一步深入探究，以期為骨肉瘤的診斷、治療及預(yù)后提供新的靶點(diǎn)。