陳 曉 魏 立 陳 重 務 森 李基偉

腫瘤進展是腫瘤內不同類型細胞相互作用的結果[1]。腫瘤浸潤淋巴細胞 (tumor infiltrating lymphocytes，TILs) 是1種能抑制腫瘤生長的特殊類型細胞[2]。最近研究發(fā)現，腫瘤免疫治療是1種有前景的癌癥治療方法[3]。CD8+ TIL被認為是免疫細胞直接殺死腫瘤細胞的效應器細胞以及免疫檢查點阻滯的靶點。研究表明，較高數量的 CD8+ 細胞與各種癌癥(包括肝癌、結腸癌和卵巢癌)更好的結局相關[4]。

研究證明CD103 在T細胞定位中具有重要作用，它被視為腸道、皮膚和女性生殖道中組織駐留 T 細胞的1個標志物[5-6]。較高數量的CD103+ T細胞為膀胱癌、子宮內膜腺癌和卵巢癌的有益預后因素[7]。

目前非小細胞肺癌(NSCLC)總體5年生存率只有10%～20%，局部復發(fā)和遠處轉移是導致肺癌患者死亡的主要原因[8]。CD8+和CD103+TIL在 NSCLC 中的作用尚不清楚。我們根據臨床標本和動物模型對 CD8和CD103 雙陽性TIL 進行研究，探索CD8 和 CD103 雙陽性TIL對于 NSCLC 的預后價值和治療價值。

1 材料與方法

1.1 NSCLC患者標本和隨訪資料

收集2005年7月至2011年2月在河南省人民醫(yī)院手術切除的220例NSCLC組織。入組標準：所有患者術前均無化療、放療、靶向治療及免疫治療史，均隨訪5年。根據世界衛(wèi)生組織 (WHO) 肺癌標準確定組織學診斷，肺癌TNM分期參照2015年NCCN指南。NSCLC 患者病理特征見表1。所有220例NSCLC 患者均納入我們的隨訪隊列，隨訪五年或隨訪至因NSCLC死亡。死于其他疾病或突發(fā)事件的患者作為生存研究中的刪失數據。220例患者的隨訪中位時間為 22個月(范圍：1～80個月)。把所有 220 例病例分為訓練隊列和測試隊列，使用簡單隨機抽樣法選擇 115 例病例納入訓練隊列，余 105 例納入測試隊列。

1.2 細胞培養(yǎng)

從Sigma-Aldrich 獲取小鼠 NSCLC 細胞株 CMT64。使用加入2 mM谷氨酰胺、10% 胎牛血清和 1% 抗生素抗真菌溶液的Waymouth's MB 752/1培養(yǎng)基(美國，伊利諾伊州，Thermo Fisher Scientific)進行細胞培養(yǎng)。以 80% 的傳代細胞鋪滿率進行繼代培養(yǎng)。

1.3 小鼠模型

使用C57BL/6J免疫活性小鼠(6周齡，20～22 g，中科院上海實驗動物中心)建立小鼠同種異體肺癌模型。將C57BL/6J衍生NSCLC細胞株CMT64細胞(2×106)接種至每只小鼠背部。接種后1周腫瘤開始發(fā)生。然后將小鼠隨機分為4個實驗組(每組n=10)。每7天一次，通過尾靜脈將抗體(分別為50 mg/kg抗CD8抗體、50 mg/kg抗CD103抗體、50 mg/kg抗CD8抗體+50 mg/kg抗CD103 抗體、100 mg/kg小鼠IgG2a)注入這些組的小鼠體內。所有抗體均購自 Thermo Fisher Scientific(美國，伊利諾伊州)。每周檢查腫瘤生長情況。根據長度和寬度計算腫瘤體積：寬度2×長度×π/6。出現大量腹腔積液、體重減輕超過 30% 和其他窘迫體征被視為觀察終點。記錄每只小鼠的生存期以進行生存分析。

1.4 免疫組化

采用免疫組化法檢測患者標本中CD8 和CD103 的表達。通過二甲苯和乙醇濃度梯度脫去標本石蠟。將切片置于檸檬酸(pH=6.0)緩沖液中水浴10 min，進行抗原修復。然后在室溫下將切片浸于5% BSA-PBS 溶液中30 min，以阻止非特異性結合。按照 1∶100 的比例將一級抗體制成稀釋液，于 4 ℃下孵育過夜。然后加入辣根過氧化物酶標記的二級抗體，于室溫下孵育1 h。應用 PBS 緩沖液沖洗3次后加入DAB。顯色并經蘇木精復染后，立即使用自來水沖洗。最后，將切片放置于光鏡下觀察。

1.5 免疫染色評分

分別計數每個顯微鏡視野中的陽性細胞數量。每份標本隨機選擇10個視野對陽性細胞進行計數。根據所有視野的陽性細胞平均數量進行析。

1.6 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 19.0軟件和GraphPad軟件對所有數據進行分析。通過t檢驗對定量數據進行比較。使用卡方檢驗和 Fisher 精確檢驗對不同的率進行比較。使用 Spearman 秩相關檢驗計算相關性。使用 Kaplan-Meier 法評估 OS 差異。通過對數秩檢驗進行單變量分析。根據患者結局和死亡預測參數值，通過接受者操作特征 (ROC) 曲線分析確定陽性細胞數量的高低分界點[9]。首先確定訓練隊列的 CD8 和 CD 103 表達分界點，然后確認測試隊列確定的分界點的預測值。雙側P<0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC中的CD8+和CD103+細胞

在所有病例中觀察到不同的 CD8+和CD103+ 細胞數量。CD8+細胞和 CD103+細胞數量之間存在正相關 (γ=0.38，P<0.0001)。

然后將 CD8+ 細胞數量和 CD103+ 細胞數量轉化為二進制數據，根據 ROC 曲線確定的分界點進一步分析。結果表明，訓練隊列CD8+ 細胞數量的最佳分界點為 24.5(>24.5 定義為陽性表達，< 24.5 定義為陰性表達)，曲線下面積(AUC)為0.683〔95% 置信區(qū)間(95% CI)：0.537-0.830〕。CD103+ 細胞數量的分界點為21.5(>21.5定義為陽性表達，<21.5 定義為陰性表達)，AUC 為 0.634(95% CI：0.501-0.766)。將患者分為兩組：CD8+ CD103+(兩者均為陽性表達)組和“其他”組。分析 NSCLC 患者臨床參數與 CD8 和 CD103 表達的關系。訓練隊列和測試隊列雙陽性表達的患者數量分別為 34例(29.6%)和3 例(36.2%)。隨訪結束時因為在NSCLC 死亡患者和存活患者之間檢測到CD8和CD103表達的顯著差異(訓練隊列和測試隊列P值均<0.001)。與存活患者相比，死于 NSCLC 患者的雙陽性表達比例較低(表 1)。

表1 CD8、CD103 表達與 NSCLC 臨床病理特征的相關性(例，%)

2.2 CD8 和 CD103 雙陽性表達是 NSCLC 的獨立有益預后因素

在訓練隊列患者中，CD8+ CD103+組與其他組(CD8+ CD103-、CD8- CD103+和CD8- CD103-)的生存曲線有顯著差異，P=0.001(圖1)。同樣，測試隊列患者的生存曲線顯示出相似的趨勢：與其他表達模式的患者相比，CD8+ CD103+患者具有最佳的總生存期，P<0.001(圖 2)。

圖1 訓練隊列患者中CD8+CD103+組與其他組的生存曲線

圖2 測試隊列患者中CD8+CD103+組與其他組的生存曲線

2.3 CD8+和CD103+細胞耗竭促進動物模型的腫瘤發(fā)展

小鼠模型研究數據表明，通過抗體耗竭CD8+或CD103+細胞將促進腫瘤生長。然而當CD8+和CD103+細胞均缺失時，腫瘤表現出最高的發(fā)展速度，生存期最短。CD8+和CD103+細胞耗竭也能減少抗腫瘤效應器分子(如 IFN-γ和顆粒酶B)的分泌。

3 討論

腫瘤的發(fā)展依賴于腫瘤細胞與周圍間質細胞(包括免疫細胞)之間的相互作用[10-11]。抗腫瘤免疫是一個需要多種免疫細胞參與的動態(tài)過程。因此，將更多的效應器細胞標志物納入研究對于更好的預測預后來說非常重要。CD103是一種標志物，主要表達于瘤內 T 細胞和樹突狀細胞，這兩種細胞都是抗腫瘤免疫的重要參與者。以往的研究強調了腫瘤組織中CD103+細胞在免疫治療方面的意義[12]。CD103表達的預后價值也在一些類型的癌癥中報告。本研究中，我們將CD8和CD103標志物結合起來研究其對于NSCLC的預后價值。

抗腫瘤免疫是一個需要不同免疫細胞參與協(xié)作的網絡[13]。因此，為了研究CD8和CD103在NSCLC中的預后價值，我們對這兩種標志物中的任一種或將其聯合進行研究。與CD8或CD103相比，CD8和CD103組合具有最佳預測價值，表明CD8+和CD103+免疫細胞之間存在一定的協(xié)同效應。生存分析表明，與其他三種情況相比，CD8和CD103雙陽性組有最好的結局。綜合看來，所有這些數據突顯出CD8和CD103組合在預測NSCLC患者結局方面的重要性以及它們對NSCLC發(fā)展的潛在保護作用。

為了進一步確認NSCLC中CD8+和CD013+細胞的保護作用，使用異種移植小鼠 NSCLC 模型進行了體內研究。通過消耗抗體抑制CD8+和CD103+細胞，觀察到顯著較快的腫瘤生長和較短的生存期。INF-γ和顆粒酶B是抗腫瘤免疫的關鍵效應器分子[14]。我們的數據表明，CD8+和CD103+細胞消耗也能減少它們的分泌。我們患者標本的分析結果強烈支持NSCLC中CD8+和CD103+細胞的保護價值。我們的研究結果與證實CD8+和CD103+細胞抗腫瘤重要性，CD8+ T 細胞為抗腫瘤免疫應答中的摘要效應器細胞，CD103+樹突狀細胞為腫瘤微環(huán)境中的主要抗原提呈細胞的其他研究一致[15]。

總之，我們的研究表明，CD8 和 CD103 結合分析的預后價值強于任一個標志物單獨分析。腫瘤組織中較高數量的CD8+和CD103+細胞是NSCLC的有益預后因素。進一步的動物模型實驗也支持NSCLC中CD8+和CD103+細胞的保護作用。