（1.懷化市產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，湖南 懷化 418000；2.沅陵縣食品藥品工商質(zhì)量監(jiān)督管理局，湖南 沅陵 419600）

我國造酒歷史悠久，葡萄酒作為深受人民群眾喜愛的酒精飲料之一，其釀造多是通過將新鮮葡萄（或葡萄汁）經(jīng)發(fā)酵制成。研究指出，適度飲酒對機(jī)體具有一定的保健效果，這是因?yàn)槠咸丫浦懈缓邹继J醇、黃酮類、多酚類等物質(zhì)，其中白藜蘆醇具有保護(hù)心血管、抑制腫瘤、抗氧化、消除自由基、預(yù)防糖尿病、預(yù)防心肌病等功效[1]。但目前不同葡萄酒品種中白藜蘆醇含量的測定方法仍無完全統(tǒng)一，高效液相色譜法（HPLC）是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測，從而實(shí)現(xiàn)對試樣的分析[2]。為此，本文就高效液相色譜法（HPLC）測定葡萄酒中白藜蘆醇含量進(jìn)行分析和研究。

1 儀器與試劑

①儀器：美國Agilent 1100高效液相色譜儀，二極管陣列DAD檢測器、上海光譜SP765P紫外可見分光光度計(jì)，四元及真空脫氣泵、賽多利斯BSA224S電子分析天平、自動(dòng)進(jìn)樣器、Bolong超清清洗機(jī)、一次性濾器（0.45 μm）、濾膜、PHS-25pH計(jì)等。②試劑與標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)對照品白藜蘆醇（純度98%）由中國藥品生物制品檢定所提供；葡萄酒：寧夏西夏王葡萄酒業(yè)有限公司市售的2014年份西夏王干紅（赤霞珠）、西夏王干白（貴人香及霞多麗），乙腈、甲醇為色譜純，乙醇為國產(chǎn)分析純，超純水等，均為天津科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 制備標(biāo)準(zhǔn)品及供試品溶液

精密量取標(biāo)準(zhǔn)對照品白藜蘆醇10 mg，將其置于10 mL甲醇中充分溶解制成1 mg/mL乙醇溶液（儲(chǔ)備液），精密量取適量置于甲醇中溶解并稀釋制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于冰箱低溫（4 ℃）保存待用，HPLC分析前，采用一次性有機(jī)濾器濾過處理，采用超聲除去氣泡，時(shí)間30 min。另取適量不同品牌干紅及干白葡萄酒經(jīng)濾膜（0.45 μm）過濾待用。

2.2 色譜條件

色 譜 柱，Agilent 1100-C18柱（4.6 mm×250 mm，10 μm）；流動(dòng)相，乙腈-水（體積比為70∶30）；柱溫，30 ℃；檢測波長，306 nm；流速，1.0 mL/min；進(jìn)樣量，10 μL。色譜圖如圖1所示。

圖1 樣品中白藜蘆醇的色譜圖

2.3 線性關(guān)系

分別精密吸取不同質(zhì)量濃度的儲(chǔ)備液注入液相色譜儀內(nèi)，于上述色譜條件下分析、測定峰面積。其中縱坐標(biāo)、橫坐標(biāo)分別為峰面積、對照品溶液含量，分析后得到回歸方程[3]：Y（葡萄酒白藜蘆醇峰面積）=19 970.67X-1 182.13（X為葡萄酒白藜蘆醇含量），線性相關(guān)系數(shù)r=0.999 8。葡萄酒中白藜蘆醇在0.227～45.003 μg范圍內(nèi)峰面積與各自含量保持著良好線性關(guān)系，其中分別利用3倍、10倍信噪比進(jìn)行檢測，結(jié)果檢測限、定量限分別為0.074 7、0.228 μg/mL。

2.4 穩(wěn)定性及加樣回收率試驗(yàn)

取標(biāo)準(zhǔn)品溶液7.5μg/mL，參照2.1方法分別于0、1、3、5、8、12 h各進(jìn)樣10 μL進(jìn)行含量測量，共測量6次，分別記錄峰面積[4]，結(jié)果顯示白藜蘆醇峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值為2.25%，其在12 h內(nèi)的穩(wěn)定性均較好。另取標(biāo)準(zhǔn)品溶液5份，分別加入7.5 μg/mL白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品，參照2.1方法每次進(jìn)樣10 μL，結(jié)果顯示葡萄酒白藜蘆醇的平均加樣回收率為97.10%，準(zhǔn)確度較高。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.875、7.5、45 μg/mL參照2.1方法于同等色譜條件下重復(fù)進(jìn)行8次以上試驗(yàn)，記錄各次峰面積。通過分析，白藜蘆醇峰面積RSD均＜2.0%，精密度良好。

3 討論

3.1 溶劑于檢測波長選擇

將白藜蘆醇分別溶于水、乙醚、乙醇及乙腈水中，經(jīng)濾膜濾過后采用進(jìn)樣器取配好適量溶液注入進(jìn)樣閥，定量10 μL，采用HPLC法對葡萄酒中的白藜蘆醇進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)對照品峰面積與溶劑呈正相關(guān)性。經(jīng)分光光度計(jì)掃描分析顯示，白藜蘆醇在檢測波長為306 nm時(shí)的吸收峰較大，故本文于HPLC法下選用306 nm作為檢測波長。

3.2 流動(dòng)相選擇

本文采用不同比例的乙腈水溶液進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果提示二者按照體積比為70∶30混合、提取、脫脂后經(jīng)液相色譜儀下檢測出的干擾成分最少，脫脂效果最佳。70∶30的乙腈水進(jìn)行于流速1 mL/min，HPLC法下檢測白藜蘆醇，結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)品峰面積與實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相的呈較好的正相關(guān)性，即其峰面積越大，流動(dòng)相越好。其中在Agilent 1100-C18柱（4.6 mm×250 mm，10 μm）色譜柱，檢測波長306 nm，流動(dòng)相乙腈-水，柱溫30 ℃，，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。

4 結(jié)語

白藜蘆醇是存在于葡萄皮中的一種非類黃酮天然活性物質(zhì)，是葡萄在應(yīng)激霉菌的感染和作用下所產(chǎn)生的具有降血脂、抗氧化以及降低血液黏稠度的保健效果。白藜蘆醇微溶于水，但易溶于乙醇，葡萄酒的制備過程主要有干紅和干白兩種工藝，其中干紅葡萄酒是指將葡萄進(jìn)行帶皮發(fā)酵，因此在發(fā)酵過程中，白藜蘆醇能夠通過乙醇的浸提而從葡萄皮中轉(zhuǎn)移到葡萄醪中；干白葡萄酒的制備是利用純汁進(jìn)行發(fā)酵，這使得富含白藜蘆醇的葡萄皮與葡萄汁被早早分離，故市場上將白藜蘆醇質(zhì)量濃度的測定結(jié)果作為葡萄酒品質(zhì)衡量和評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一。

目前，對于白藜蘆醇的檢測方法多種多樣，如毛細(xì)管電泳法、薄層層析法、氣相色譜法、液相色譜法及色質(zhì)聯(lián)用等。但通過本研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果，高效液相色譜法不僅操作便捷，而且耗時(shí)較短，結(jié)果準(zhǔn)確，因此適用于葡萄酒中白藜蘆醇含量的測定。