張夢(mèng)瑤 ，楊 峰，劉開(kāi)東，劉積鳳，柳 楠，賀建寧*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；3.青島畜牧獸醫(yī)研究所，山東青島 266121）

隨著生活水平的提高，人類對(duì)羊毛的需求量和品質(zhì)要求不斷提升，羊毛的產(chǎn)量與質(zhì)量問(wèn)題越來(lái)越引發(fā)關(guān)注。羊毛產(chǎn)量由毛囊組織結(jié)構(gòu)和性狀共同決定，探究毛囊發(fā)育的規(guī)律和結(jié)構(gòu)特征是研究毛囊生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控機(jī)制的基礎(chǔ)，同時(shí)毛囊發(fā)育對(duì)羊毛性狀有重要影響[1-3]。敖漢細(xì)毛羊作為最具有代表性的細(xì)毛羊之一，研究其毛囊發(fā)育的調(diào)控機(jī)制具有重要價(jià)值。近年來(lái)，Stenn等[4]在成年綿羊身上對(duì)毛囊的周期性生長(zhǎng)變化展開(kāi)了研究，得出初級(jí)毛囊的密度活動(dòng)變化較次級(jí)毛囊恒定；柳楠等[5]在分子水平上研究了敖漢細(xì)毛羊羊毛性狀的形成機(jī)理，證實(shí)毛囊始發(fā)、形成與循環(huán)均共用一套調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，均需經(jīng)歷生長(zhǎng)期、退行期和靜止期；王小佳等[6]在分子層面上對(duì)細(xì)毛羊羊毛的生長(zhǎng)部位進(jìn)行了研究，得出BMPs主要表達(dá)于表皮上皮細(xì)胞和內(nèi)根鞘細(xì)胞中，在肩部和腹股溝部表達(dá)較明顯，且在肩部表達(dá)量較高，差異倍數(shù)在2倍以上。

有研究報(bào)道，BMPs在大量動(dòng)物的卵巢、前列腺、皮膚等組織中均能檢測(cè)到。曾德會(huì)等[6]研究發(fā)現(xiàn)，BMP6在BMP6-HJV-Smad信號(hào)通路調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。BMP6同時(shí)也是TGF-β超家族中的一員[7]，在TGF通路中可以促進(jìn)基因表達(dá)的同時(shí)也抑制通路中某些基因的表達(dá)。楊燕燕等[8]研究蒙古羊是否雙羔直接受BMP6基因的控制，發(fā)現(xiàn)BMP6在發(fā)情期表達(dá)尤其明顯，特別是雙羊羔群體中。目前，對(duì)BMP6基因與家畜皮膚毛囊關(guān)系的研究主要集中在分子水平上，因此對(duì)BMP6基因在細(xì)胞水平進(jìn)行研究十分必要。本研究通過(guò)同源重組技術(shù)構(gòu)建BMP6真核表達(dá)載體及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞來(lái)進(jìn)行BMP6基因表達(dá)的定量定性分析，為此后個(gè)體層次上的研究提供堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選取健康敖漢細(xì)毛羊40日齡的胎羊（由青島畜牧所奧特種羊場(chǎng)提供）。 TRIZol（Roche）試劑、RIPA、抗體、EcoR1限制性內(nèi)切酶、pcDNA3.1質(zhì)粒、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、Lipofectamine2000等均購(gòu)自青島鑫恒一有限公司。Leica DMIRB 型倒置顯微鏡購(gòu)于青島鑫恒一有限公司、Redbio CFX ConnectTM熒光定量PCR系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 利用試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行提取并反轉(zhuǎn)錄。選取綿羊BMP6基因組（GenBank登錄號(hào)為XM-015102858.1）CDS區(qū)、結(jié)合pcDNA3.1載體序列，在CDS區(qū)外側(cè)通過(guò)Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，在上下游引物5'端加入同源臂，完成后的引物序列：上游引物：5'-TTTAAACTTAAGCTTGGTACCATGATTCCTGGTA ACCGAATGCTG-3'，下游引物：5'-TGGATCCGAGCTC GGTACCTCAGCGGCACCCACATCCCTCCACTA-3'，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，25 μL擴(kuò)增體系：DNA模板1 μL（2 183.1 μg/mL），上、下游引物各1 μL（10 μmol/L），GreeMix 12.5 μL（4mmol/L），ddH2O 9.5 μL。

1.2.2 BMP6基因與pcDNA3.1質(zhì)粒同源重組 切膠回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，pcDNA3.1質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行EcoR1限制性單酶切。酶切體系：EcoR1 1 μL，pcDNA3.1 5 μL，Buffer 5 μL，ddH2O 39 μL；37℃ 2 h。連接體系：BMP6基因 1 μL，pcDNA3.1 1 μL，SoSo 5 μL，ddH2O 3 μL，50℃ 10 min。轉(zhuǎn)化 DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞，挑單菌搖菌并進(jìn)行菌液PCR鑒定陽(yáng)性率，將陽(yáng)性組送往公司測(cè)序，并通過(guò)質(zhì)粒提取試劑盒提取陽(yáng)性質(zhì)粒。

1.2.3 成纖維細(xì)胞的培養(yǎng) 取40日齡胎羊用75%酒精和PBS清洗。去除頭部和四肢剩余軀干用眼科剪將其剪成1.5～2.0 mm3大小的組織塊，滴加37.0℃預(yù)熱的胎牛血清，放置到CO2培養(yǎng)箱（37℃，5.0% CO2）培養(yǎng)4 h后加培養(yǎng)液。24 h進(jìn)行換液，每天定時(shí)在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到約95%進(jìn)行傳代。棄掉舊培養(yǎng)液，用PBS洗滌3次，0.25%的胰蛋白酶37.0℃消化4 min，培養(yǎng)液終止消化。按1:3傳代，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中待細(xì)胞密度達(dá)95%后，再次傳代培養(yǎng)[9]。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 用Lipofectamine2000進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。孵育體系：實(shí)驗(yàn)組為脂質(zhì)體20 μL、DMEM（不含雙抗）480 μL；對(duì)照組為脂質(zhì)體20 μL、DMEM（不含雙抗）480 μL，混勻，靜置10 min。轉(zhuǎn)染體系：實(shí)驗(yàn)組為pcDNA3.1-BMP6 40 μL、DMEM（不含雙抗）460 μL；對(duì)照組為DMEM 500 μL，靜置20 min；各加入4 mL DMEM，37℃培養(yǎng)6 h后換液，培養(yǎng)36 h。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后實(shí)時(shí)熒光定量PCR 對(duì)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到95%時(shí)用TRIZol（Roche）裂解細(xì)胞提取RNA。利用核酸測(cè)定儀測(cè)定濃度和純度，用試劑盒（Roche）將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)敖漢細(xì)毛羊BMP6基因的全序列和綿羊GAPDH的全序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)BMP6和GAPDH基因的引物序列見(jiàn)表1。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性7 min；95℃變性 40 s，60℃退火40 s，72℃ 延伸30 s，共45個(gè)循環(huán)。樣品各進(jìn)行3次重復(fù)，采用Ct（2-ΔΔCt）值法計(jì)算BMP6相對(duì)于內(nèi)參基因GAPDH的表達(dá)量。利用SPSS 19.0軟件中t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以P＜0.01作為差異極顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。

1.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后Western Blotting檢測(cè)BMP6蛋白表達(dá) 樣品分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)樣品3個(gè)平行。首先用細(xì)胞裂解液RIPA提取細(xì)胞中蛋白，β-actin作為內(nèi)參。對(duì)提取的蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，用5%BSA對(duì)蛋白進(jìn)行封閉2 h；TBST振蕩洗膜4次/5 min；將一抗按1:2 000進(jìn)行稀釋，孵育PDF膜4℃ 12 h；TBST振蕩洗膜4次/5 min；山羊抗兔的二抗按1:2 000稀釋，孵育PDF膜1.5 h；曝光液1:1的比例配置，在暗室中進(jìn)行曝光拍照。所得結(jié)果用Image J軟件分析灰度值，灰度值的比值用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

表1 引物信息

2 結(jié) 果

2.1 BMP6目的基因擴(kuò)增 以敖漢細(xì)毛羊cDNA為模板，對(duì)目的基因片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。利用2%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果表明，引物擴(kuò)增的條帶明亮無(wú)雜帶，產(chǎn)物大小為537 bp （圖1），與已知的目的基因片段大小相同，可用于后期實(shí)驗(yàn)。

圖1 BMP6基因PCR擴(kuò)增

2.2 pcDNA3.1載體單酶切及純化 對(duì)pcDNA3.1進(jìn)行單酶切，酶切后利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如圖2所示，1、2是對(duì)pcDNA3.1載體的EcoR1單酶切，酶切效果良好，pcDNA3.1載體5 428 bp，與圖中條帶所吻合，顯示酶切成功，切膠回收可用于后期連接實(shí)驗(yàn)。

圖2 pcDNA3.1載體單酶切鑒定

2.3 表達(dá)載體pcDNA3.1與目的片段重組及鑒定 對(duì)pcDNA3.1載體單酶切的片段進(jìn)行膠回收后用SoSo試劑盒將目的片段和pcDNA3.1載體進(jìn)行連接，對(duì)菌液進(jìn)行PCR電泳鑒定，如圖3所示，在537 bp處有單一明亮的條帶，為BMP6基因。菌液送至公司進(jìn)行基因測(cè)序，利用BLAST與已知目的基因的序列進(jìn)行比對(duì)，表明目的基因與pcDNA3.1載體連接成功（圖4）。同時(shí)對(duì)重組的質(zhì)粒進(jìn)行提取， 1～2為pcDNA3.1-BMP6重組質(zhì)粒，大小為5 965 bp，與圖中條帶相符（圖5），表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖3 表達(dá)載體pcDNA3.1的鑒定-PCR擴(kuò)增圖

圖4 表達(dá)載體菌液的測(cè)序?qū)Ρ?/p>

圖5 pcDNA3.1-BMP6重組質(zhì)粒的提取

2.4 細(xì)胞培養(yǎng) 定時(shí)用電子倒置顯微鏡觀察成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。細(xì)胞生長(zhǎng)24 h可觀察到細(xì)胞慢慢貼壁，有圓形的，有梭形的，還有一些游離組織。培養(yǎng)4 d后，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞密度達(dá)到大約95%時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代（圖6）。經(jīng)傳代后細(xì)胞開(kāi)始生長(zhǎng)速度稍慢，12 h后增殖迅速加快，細(xì)胞形態(tài)仍然呈現(xiàn)梭形，生長(zhǎng)情況良好，可用于下一步轉(zhuǎn)染（圖7）。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)BMP6基因表達(dá) 以成纖維細(xì)胞的cDNA為模板，對(duì)目的基因BMP6和內(nèi)參基因GAPDH片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。2%瓊脂糖凝膠電泳分析表明，引物擴(kuò)增的條帶明亮，GAPDH產(chǎn)物大小為125 bp ，BMP6產(chǎn)物大小為116 bp（圖8），與已知的內(nèi)參基因、目的基因大小均相同，可繼續(xù)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。

圖6 成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)（×100）

圖7 成纖維細(xì)胞傳代培養(yǎng)（×100

圖8 內(nèi)參基因GAPDH（A）目的基因BMP6擴(kuò)增產(chǎn)物（B）

目的基因BMP6和內(nèi)參基因GAPDH的擴(kuò)增曲線、熔解曲線如圖9所示，清晰整齊，并且目的基因和內(nèi)參基因的熔解曲線上未出現(xiàn)雜亂的峰，表明在實(shí)時(shí)熒光定量PCR過(guò)程中引物特異性較高，沒(méi)有產(chǎn)生二聚體，由此得到了特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，因此設(shè)計(jì)的引物可以用來(lái)進(jìn)行定量分析。如圖10所示，BMP6基因經(jīng)過(guò)質(zhì)粒構(gòu)建轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞后與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞之間差異極顯著（P＜0.01）。

圖9 BMP6和GAPDH 溶解曲線峰值圖（A）和擴(kuò)增曲線圖（B）

圖10 BMP6基因mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.6 BMP6蛋白表達(dá)的檢測(cè) 以成纖維細(xì)胞提取的蛋白為模板進(jìn)行Western Blotting，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染BMP6基因的蛋白條帶明顯亮于未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組（圖11），經(jīng)ImageJ和SPSS19.0分析得實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染BMP6基因蛋白的表達(dá)極顯著高于未轉(zhuǎn)染組（P＜0.01）（圖 12），說(shuō)明質(zhì)粒 pcDNA3.1-BMP6 能高效表達(dá)BMP6 基因。

圖11 BMP6 基因表達(dá)蛋白條帶

圖12 BMP6基因蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

目前，調(diào)節(jié)毛囊形態(tài)發(fā)生的信號(hào)分子主要分為Wnt通路、TNF家族、FGF家族、BMP家族、Shh通路、TGF家族和NOTCH通路[10]7類，這些信號(hào)分子之間都會(huì)相互作用調(diào)控，有些是毛囊發(fā)育的促進(jìn)物，有些是抑制物。崔向榮等[11]研究證明，BMP6參與顆粒細(xì)胞凋亡，BMP6蛋白突變易導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡，從而引起一系列相應(yīng)機(jī)制調(diào)節(jié)。以小鼠為模型研究，BMPs在毛球間質(zhì)細(xì)胞和表皮里廣泛表達(dá)[8]，主要是在胚胎期毛囊形成和出生后毛囊周期循環(huán)過(guò)程中起作用[12]。本研究利用成纖維細(xì)胞，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR，在mRNA的水平上檢測(cè)BMP6基因在成纖維細(xì)胞中過(guò)表達(dá)。王小佳等[13]驗(yàn)證了BMP4基因能夠在細(xì)毛羊的腹股溝和肩部均抑制毛囊發(fā)育。BMP6基因和BMP4同屬于BMP家族，是一種抑制毛囊發(fā)育的信號(hào)分子。本研究在細(xì)胞水平對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，經(jīng)轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞后BMP6基因蛋白表達(dá)量明顯升高。BMPs信號(hào)不僅調(diào)控著上皮細(xì)胞的增殖與分化，維持著上皮內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[14]，還控制著毛發(fā)角質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞增殖，進(jìn)而毛囊毛乳頭的大小[15]、毛發(fā)類型和毛纖維直徑將受到BMPs信號(hào)的控制。Noggin作為BMP信號(hào)通路中的抑制劑，進(jìn)而誘導(dǎo)次級(jí)毛囊發(fā)育[16]，Noggin缺失，BMP信號(hào)通路中的基因會(huì)增強(qiáng)表達(dá)，抑制毛發(fā)的生成，因而出現(xiàn)嚴(yán)重的光禿現(xiàn)象，這一現(xiàn)象極力闡述了BMP信號(hào)對(duì)毛發(fā)的抑制。BMP還會(huì)通過(guò)Smad類等細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子以及Wnt等相鄰信號(hào)通路對(duì)表皮和毛囊發(fā)育進(jìn)行調(diào)節(jié)[17]。許多研究證明，BMP6基因在毛囊發(fā)育過(guò)程中起著十分重要的作用。

本文研究借助前人的研究結(jié)果對(duì)BMP6在細(xì)胞層次上進(jìn)一步研究，選擇40日齡的胎羊培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)能力強(qiáng)，活力高，容易獲得，結(jié)果穩(wěn)定性更高，實(shí)驗(yàn)周期短。實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新點(diǎn)主要是利用同源重組技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體，相比TA克隆技術(shù)更為簡(jiǎn)便快速，不會(huì)引入多余的堿基，目的基因可以更準(zhǔn)確地定位在靶位點(diǎn)上[18]。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組的mRNA量極顯著高于未轉(zhuǎn)染組；其次，已知BMP6蛋白分子量約為19.6 ku，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞BMP6基因表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照。經(jīng)過(guò)顯色曝光后條帶明顯比對(duì)照組的條帶黑、寬。經(jīng)Image J分析，相對(duì)表達(dá)的灰度值也明顯高于對(duì)照組。將目的基因與內(nèi)參基因的灰度值的比值進(jìn)行SPSS分析，結(jié)果顯示差異極顯著，這進(jìn)一步說(shuō)明了轉(zhuǎn)染后BMP6基因的過(guò)表達(dá)。本研究中，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染，BMP6基因的mRNA和蛋白表達(dá)量明顯升高，這從細(xì)胞層次上研究了與羊毛有關(guān)的基因。BMP6基因具有抑制毛囊發(fā)育的作用，本研究在細(xì)胞層次上驗(yàn)證了BMP6基因的過(guò)表達(dá)，其過(guò)表達(dá)的同時(shí)也將影響相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。作為上、下調(diào)基因，BMP6基因過(guò)表達(dá)會(huì)影響它直接控制的基因也進(jìn)行相應(yīng)的表達(dá)增強(qiáng)、減弱，這也為以后個(gè)體水平上的研究提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，有助于解決綿羊羊毛生長(zhǎng)的問(wèn)題。

4 結(jié) 論

研究通過(guò)利用同源重組技術(shù)對(duì)載體pcDNA3.1-BMP6的構(gòu)建、載體轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western Blotting等，成功地構(gòu)建了表達(dá)載體pcDNA3.1-BMP6并轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，BMP6基因過(guò)表達(dá)，mRNA表達(dá)量和蛋白的表達(dá)量均極顯著高于對(duì)照組，為進(jìn)一步在個(gè)體水平上研究其功能奠定基礎(chǔ)。