辛向榮，賀 琴，游金明，葉亞玲，鄧宸璽

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江西省動物營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省營養(yǎng)飼料開發(fā)工程中心，江西南昌330045）

谷氨酰胺（Glutamine，Gln）是腸道細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周轉(zhuǎn)的能量底物[1]，是嘌呤和蛋白的氮源供體，用來維持依賴于ATP的代謝過程的順利進(jìn)行。Gln代謝產(chǎn)生的鳥氨酸是多胺合成的重要前體，而多胺是一種脂肪組胺類，在IPEC-1的分化、增殖及受損腸道上皮修復(fù)等過程中發(fā)揮重要作用[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，添加Gln能保護(hù)腸道上皮緊密連接蛋白，防止腸道氧化損傷，并刺激蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞增殖[4-6]，Gln對維持?jǐn)嗄套胸i腸道正常形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能，緩解斷奶應(yīng)激損傷具有重要作用[7-9]。但Gln溶解度低，具有熱不穩(wěn)定性，影響了其在動物生產(chǎn)上的應(yīng)用[10]。丙氨酰-谷氨酰胺（Alanyl-Glutamine Dipeptide，Ala-Gln）被吸收后可迅速釋放Gln，可以解決Gln的應(yīng)用問題。此外， Ala-Gln已成為人類營養(yǎng)研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)，在全腸外營養(yǎng)中的研究日益成熟，這為Ala-Gln在畜禽飼料中應(yīng)用提供了理論支撐[11-12]。自噬（Autophagy）可以定義為細(xì)胞“自食”的一個(gè)過程，細(xì)胞依賴溶酶體降解受損蛋白、損傷或衰老的細(xì)胞器等細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可被多種應(yīng)激所觸發(fā)[13-14]。這是機(jī)體面對新陳代謝應(yīng)激進(jìn)化出的一種防御反應(yīng)。當(dāng)處于營養(yǎng)缺乏狀態(tài)時(shí)細(xì)胞通過自噬作用回收降解后胞質(zhì)蛋白，并利用非必需細(xì)胞器分解提供代用能源[15]。本研究旨在通過檢測IPEC-1細(xì)胞活力、抗氧化酶活力及丙二醛（MDA）含量，免疫熒光技術(shù)檢測氧化應(yīng)激狀態(tài)IPEC-1的自噬程度，研究H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激狀態(tài)下不同濃度的Ala-Gln對IPEC-1的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 本試驗(yàn)采用的Ala-Gln購自上海超強(qiáng)化工有限公司，純度≥99%。豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-1由中國科學(xué)院長沙亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所提供。

1.2 氧化應(yīng)激模型的建立 試驗(yàn)采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，棄去培養(yǎng)液。加入DMEM完全培養(yǎng)液（不含Gln和血清），再分別向每個(gè)復(fù)孔中添加0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mmol/L Ala-Gln預(yù)處理20 h。后利用H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞構(gòu)建氧化應(yīng)激模型（前期試驗(yàn)確定最佳應(yīng)激模型為400 μmol/L H2O2作用4 h），試驗(yàn)共設(shè)6個(gè)處理，每個(gè)處理8個(gè)重復(fù)。模型建立后開始以下試驗(yàn)數(shù)據(jù)的測定。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞活力 各復(fù)孔均加入100 μL濃度為1 mg/mL的MTT，培養(yǎng)4 h后，倒掉上清液，加入150 μL的二甲基亞砜，震蕩混勻10 min。用酶標(biāo)儀檢測490 nm處每孔的吸光度。

1.4 細(xì)胞抗氧化酶活性和MDA含量的檢測 將細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)上清液去除，加入細(xì)胞裂解液100 μL，混勻37℃孵育2 min，待測其中MDA含量、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）活力。采用南京建成生物工程研究所的MDA試劑盒（貨號A003-4）、GSH-Px試劑盒（貨號A005）和SOD試劑盒（貨號A001-3），按操作說明要求檢測培養(yǎng)液中SOD和GSH-Px活力及MDA含量。

1.5 LC3-II的免疫熒光定量分析 用PBS洗滌細(xì)胞5次（10 min/次），加入4%多聚甲醛室溫下固定15 min。固定后的細(xì)胞用PBS洗滌，100%甲醇-20℃透明10 min，透明后PBS洗滌，之后室溫下用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液封閉1 h。然后將細(xì)胞與抗LC-3抗體一起在抗體稀釋液（1:50 5% BSA）中4℃培養(yǎng)過夜。經(jīng)過3次TBST洗滌，再將細(xì)胞與FITC-anti-Rabbit抗體在抗體緩沖液（1:100 5% BSA）中37℃培養(yǎng)1 h。然后馬上用TBST洗滌3次（5 min/次），蒸餾水漂洗1次。取出蓋玻片，甘油封片處理，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 17.0分析軟件中ANOVA程序?qū)λ鶞y指標(biāo)進(jìn)行單因素方差、線性和二次型分析，并用Duncan′s法進(jìn)行差異顯著性比較。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P＜0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ala-Gln預(yù)處理對誘導(dǎo)氧化應(yīng)激豬小腸上皮細(xì)胞活力的影響 如圖1所示，氧化狀態(tài)下，隨Ala-Gln添加水平的提高，IPEC-1細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)（P＜0.05），且在Ala-Gln為2.00 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值。4.00 mmol/L Ala-Gln水平反而使細(xì)胞活力顯著下降（P＜0.05），但仍高于0.25、0.50、1.00 mmol/L Ala-Gln下IPEC-1細(xì)胞活力。

圖1 Ala-Gln對氧化應(yīng)激狀態(tài)IPEC-1細(xì)胞活力的影響

2.2 Ala-Gln預(yù)處理對誘導(dǎo)氧化應(yīng)激豬小腸上皮細(xì)胞抗氧化性能的影響 由表1可知，添加Ala-Gln預(yù)處理細(xì)胞，顯著提高了氧化應(yīng)激狀態(tài)IPCE-1 GSH-Px和SOD活性（P＜0.05），顯著降低了MDA含量（P＜0.05）。氧化應(yīng)激狀態(tài)下IPEC-1 GSH-Px活性隨Ala-Gln添加濃度增加而提高，而SOD活性在Ala-Gln預(yù)處理水平為0.25 mmol/L和0.50 mmol/L時(shí)活性最高，之后隨Ala-Gln添加水平提高而降低。氧化應(yīng)激狀態(tài)下IPEC-1中MDA含量隨Ala-Gln預(yù)處理水平提高而降低。

表1 Ala-Gln預(yù)處理對誘導(dǎo)氧化應(yīng)激豬小腸上皮細(xì)胞抗氧化性能的影響

2.3 Ala-Gln預(yù)處理對誘導(dǎo)氧化應(yīng)激豬小腸上皮細(xì)胞自噬蛋白LC3-II的影響 由圖2可觀察到，陽性熒光信號為LC3-II，其為自噬體的標(biāo)志蛋白，代表自噬發(fā)生。對照組細(xì)胞未經(jīng)H2O2處理，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列緊密，個(gè)別細(xì)胞出現(xiàn)陽性熒光信號，為IPEC-1正常細(xì)胞生理狀態(tài)。當(dāng)加入H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激后（圖2-A），IPEC-1細(xì)胞密度短時(shí)間降低，且細(xì)胞膜和核膜嚴(yán)重破損，加速外滲細(xì)胞質(zhì)到培養(yǎng)基中，細(xì)胞核幾乎消融，且胞內(nèi)很少出現(xiàn)陽性熒光信號，IPEC-1細(xì)胞逐漸死亡；當(dāng)在培養(yǎng)基中加入Ala-Gln預(yù)處理后，隨Ala-Gln添加水平提高IPEC-1生物膜結(jié)構(gòu)趨于完整，胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)和核內(nèi)遺傳物質(zhì)得到很好的保護(hù)，細(xì)胞密度也隨之提高，細(xì)胞質(zhì)中陽性熒光信號增強(qiáng)，當(dāng)Ala-Gln預(yù)處理量為4.00 mmol/L時(shí)，細(xì)胞生理結(jié)構(gòu)同正常對照組相比無顯著差異，與Ala-Gln預(yù)處理量為2.00 mmol/L時(shí)細(xì)胞相比，胞內(nèi)熒光信號有減少趨勢。

3 討 論

3.1 Ala-Gln預(yù)處理對誘導(dǎo)氧化應(yīng)激豬小腸上皮細(xì)胞抗氧化性能的影響 Gln是體內(nèi)重要的抗氧化劑，其作為重要的免疫增強(qiáng)因子，對維持內(nèi)環(huán)境氧化和還原穩(wěn)態(tài)起到重要作用[16]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞培養(yǎng)基中添加Gln可減緩脂多糖或H2O2引起的氧化應(yīng)激[5]。Gln主要通過減少氧化應(yīng)激下的細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)抗氧化酶防御作用、熱休克蛋白的表達(dá)及誘導(dǎo)細(xì)胞自噬來發(fā)揮作用[17]。Gln兼?zhèn)涿庖哒{(diào)節(jié)與抗氧化能力，這為在臨床營養(yǎng)治療中的應(yīng)用開辟了廣闊的應(yīng)用空間。

前期研究發(fā)現(xiàn)，400 μmol/L的H2O2可顯著降低IPEC-1的活力，顯著降低IPEC-1內(nèi)GSH-Px和SOD酶的活性，顯著提高細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量[18]。本試驗(yàn)中預(yù)添加不同水平Ala-Gln后IPEC-1細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)，且添加2.00 mmol/L Ala-Gln時(shí)氧化應(yīng)激狀態(tài)下IPEC-1細(xì)胞活力達(dá)到最大值，當(dāng)Ala-Gln添加量為4.00 mmol/L時(shí)，細(xì)胞活力顯著下降，但仍高于0.50、1.00 mmol/L Ala-Gln預(yù)處理過的IPEC-1細(xì)胞活力，該結(jié)果與席鵬彬等[19]研究結(jié)論相似。

圖2 Ala-Gln預(yù)處理對誘導(dǎo)氧化應(yīng)激豬小腸上皮細(xì)胞自噬蛋白LC3-II的影響

3.2 Ala-Gln預(yù)處理對誘導(dǎo)氧化應(yīng)激豬小腸上皮細(xì)胞自噬蛋白LC3-II的影響 氧化應(yīng)激能夠造成IPEC-1內(nèi)自由基的大量堆積，其中對生物膜上多不飽和脂肪酸過氧化損傷最為嚴(yán)重。從本試驗(yàn)免疫熒光結(jié)果中可以看出，氧化應(yīng)激狀態(tài)小腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和核膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，使其流動性降低，通透性極大提高，胞內(nèi)有機(jī)物質(zhì)加速外滲，蛋白和核酸氧化變性，失去正常生理功能，IPEC-1死亡率極大提高，細(xì)胞密度顯著降低。研究發(fā)現(xiàn)，Ala-Gln具有抗氧化應(yīng)激能力，并且是細(xì)胞周轉(zhuǎn)的主要燃料和氮源供體，在受損腸道上皮修復(fù)等過程中發(fā)揮重要作用[10,20-21]。IPEC-1細(xì)胞培養(yǎng)基中缺乏Gln 8 h內(nèi)，會降低IPEC-1細(xì)胞數(shù)量，增加細(xì)胞自噬體的數(shù)量，并增強(qiáng)細(xì)胞LC3B-II的表達(dá)[22]。細(xì)胞發(fā)生自噬過程的特征在于所謂雙膜囊結(jié)構(gòu)自噬體的形成，這種結(jié)構(gòu)由Atg12-Atg5-Atg16復(fù)合體和微管結(jié)合蛋白輕鏈3（LC3-I）-磷脂軛合物（LC3-II）介導(dǎo)[17,23]。Sakiyama等[17]研究發(fā)現(xiàn)，Gln能夠增加腸上皮細(xì)胞內(nèi)微管結(jié)合蛋白輕鏈3-磷脂軛合物（LC3-II）的數(shù)量，提高細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量，同時(shí)能夠通過控制mTOR和p38 MAP激酶通路來誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，保護(hù)生理應(yīng)激狀態(tài)細(xì)胞。自噬對機(jī)體起保護(hù)作用，還是對機(jī)體造成危害，取決于機(jī)體所處的生理?xiàng)l件[24]。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞受到氧化應(yīng)激使得IPEC-1細(xì)胞密度短時(shí)間降低，且細(xì)胞膜和核膜嚴(yán)重破損，加速外滲細(xì)胞質(zhì)到培養(yǎng)基中，細(xì)胞核幾乎消融，細(xì)胞死亡導(dǎo)致僅能從個(gè)別細(xì)胞中觀察到自噬體。而Ala-Gln預(yù)處理后的細(xì)胞，IPEC-1生物膜結(jié)構(gòu)趨于完整，胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)和核內(nèi)遺傳物質(zhì)得到很好保護(hù)，細(xì)胞密度也隨之提高，其中Ala-Gln添加水平為1.00 、2.00 mmol/L時(shí)，IPEC-1胞內(nèi)自噬體較多，細(xì)胞趨于完整狀態(tài)。當(dāng)Ala-Gln預(yù)處理量為4.00 mmol/L時(shí)，細(xì)胞生理結(jié)構(gòu)同正常對照組相比無顯著差異，且與Ala-Gln預(yù)處理量為2.00 mmol/L時(shí)的細(xì)胞相比，胞內(nèi)熒光信號有減少趨勢。這可能是由于隨著應(yīng)激狀態(tài)緩解，自噬體降低，細(xì)胞逐漸恢復(fù)為正常狀態(tài)。

根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果可推測，當(dāng)IPEC-1遭受氧化應(yīng)激時(shí)，Ala-Gln能夠通過提高抗氧化物酶活性，減少生物膜上脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，保護(hù)脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，使膜的流動性和通透性不變，進(jìn)而維持細(xì)胞中蛋白和核酸正常生物功能。而另一方面，在氧化應(yīng)激生理?xiàng)l件下，Ala-Gln的添加使得細(xì)胞中自噬體增加，細(xì)胞通過自噬作用利用胞漿內(nèi)受損的蛋白和細(xì)胞器等細(xì)胞結(jié)構(gòu)，為抗氧化物酶的表達(dá)與合成提供原料和能量，增強(qiáng)營養(yǎng)缺乏狀態(tài)時(shí)細(xì)胞防御能力，緩解細(xì)胞受到氧化應(yīng)激的損傷。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)添加不同水平的Ala-Gln可顯著提高氧化應(yīng)激狀態(tài)下IPEC-1細(xì)胞中GSH-Px、SOD酶活性，顯著降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量，增強(qiáng)細(xì)胞自噬以緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激，表明Ala-Gln對氧化應(yīng)激狀態(tài)下IPEC-1具有較強(qiáng)的抗氧化和細(xì)胞防御作用。