李 琦，李雁冰，王 碩，孫思怡，韓淑敏，張 帆，魏國(guó)生，李井春

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

伴隨著我國(guó)畜牧業(yè)的蓬勃發(fā)展，豬精液的液態(tài)保存技術(shù)得到了長(zhǎng)足的進(jìn)步。目前我國(guó)規(guī)模化豬場(chǎng)95%以上使用液態(tài)保存精液進(jìn)行人工授精，少部分使用冷凍精液[1]。雖然液態(tài)保存精液的精子活率以及母豬受胎率優(yōu)于冷凍精液，但其在保存時(shí)間方面存在嚴(yán)重劣勢(shì)[2]?，F(xiàn)代物流業(yè)的快速發(fā)展和豬同期發(fā)情技術(shù)日漸成熟使得豬液態(tài)保存精液在全球?qū)嵤┤斯な诰饾u成為可能[3]。我國(guó)擁有著豐富的豬品種資源有待開(kāi)發(fā)，但豬精液液態(tài)保存方面的相關(guān)技術(shù)仍不成熟，其相關(guān)機(jī)理也還不清楚。

如何進(jìn)一步延長(zhǎng)豬精液液態(tài)的保存時(shí)間以及提高精液質(zhì)量，成為人工授精技術(shù)研究的熱點(diǎn)。有報(bào)道稱通過(guò)負(fù)壓處理可提高綿羊的精液質(zhì)量和受精率[4]。此外，豬的附睪環(huán)境是低氧高滲透壓，模擬豬的附睪環(huán)境有助于提高精子的質(zhì)量[5]。然而關(guān)于負(fù)壓對(duì)豬精子質(zhì)量的影響的研究鮮有報(bào)道。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)液態(tài)17℃保存精子的活率、pH、總抗氧化能力（Total Antioxidant Capacity，T-AOC）和精液中過(guò)氧化氫（H2O2）含量來(lái)評(píng)價(jià)負(fù)壓對(duì)精子代謝和精子質(zhì)量的影響，為豬精液常溫保存的研究提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 辣根過(guò)氧化氫酶等均購(gòu)自Sigma公司。T-AOC試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。稀釋液采用改良Modena溶液，4 mg/mL BSA（牛血清白蛋白，現(xiàn)用現(xiàn)配）。無(wú)菌操作臺(tái)過(guò)濾，4℃保存。

1.2 豬精液的準(zhǔn)備 實(shí)驗(yàn)精液采自黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)豬場(chǎng)20月齡健康成年長(zhǎng)白種公豬，通過(guò)手握法收集4頭長(zhǎng)白公豬富含精子的精液30～50 mL。精液用改良的Modena溶液稀釋3倍，在收集后2 h內(nèi)將稀釋后的樣品運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。檢測(cè)活率在80%以上方可使用。通過(guò)離心（750×g，5 min）洗滌1次后，將精子以1×108cells/ mL的濃度重懸于Modena稀釋液，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.3 精液的保存 將稀釋好的精液分為4組，裝于15 mL離心管中，分別裝入負(fù)壓保存裝置。用真空漿將其壓強(qiáng)調(diào)整至正常大氣壓（對(duì)照組）、負(fù)0.02 MPa（P2組）、負(fù)0.04 MPa（P4組）、負(fù)0.08 MPa（P8組）。負(fù)壓裝置由250 mL玻璃廣口瓶、橡膠塞以及球星閥組成，橡膠塞周圍涂抹凡士林以增強(qiáng)密封性。為減少細(xì)菌等微生物對(duì)精液品質(zhì)的影響，所有操作需在無(wú)菌操作臺(tái)進(jìn)行，每24 h測(cè)定精子活率、pH、T-AOC、H2O2含量等指標(biāo)，每次測(cè)定取1 mL樣品，剩余樣品裝回負(fù)壓保存裝置之后用真空泵抽負(fù)壓（真空泵上接有壓力表以顯示負(fù)壓值）。之后置于17℃恒溫箱中保存，當(dāng)精子活率低于20%時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.4 精子指標(biāo)的檢測(cè)

1.4.1 精子活率及pH檢測(cè) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每24 h取出1 mL精液，使用邁朗全自動(dòng)精子分析儀檢查精子活率，做好實(shí)驗(yàn)記錄。利用酸度儀分別檢測(cè)原精液、稀釋液以及稀釋后精液的pH。每天檢測(cè)1次，觀察其變化規(guī)律。

1.4.2 T-AOC活性測(cè)定 操作按照南京建成生物工程研究所總抗氧化能力試劑盒進(jìn)行，檢測(cè)方法根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定。分別在保存的0、1 d測(cè)定，之后每48 h測(cè)定各組精子的T-AOC。

1.4.3 精液H2O2含量測(cè)定 將精液1 800 r/min離心，取上清液20 μL，用蒸餾水稀釋到1 mL，加入0.8 mg/mL的HRP 0.75 mL，0.8 mg/mL的苯酚紅0.45 mL，0.8 mL PBS，室溫 5 min后，加入 40 μL 3 mol/L 的 NaOH，610 nm處測(cè)吸光度OD，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出培養(yǎng)液中H2O2濃度。分別在保存的0、1 d測(cè)定，之后每48 h測(cè)定不同組培養(yǎng)液中H2O2的濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 利用StatView 5.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行方差分析和多重比較分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，P＜0.05為差異顯著。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)數(shù)為4次。

2 結(jié) 果

2.1 不同負(fù)壓對(duì)17℃保存豬精子活率的影響 由表1可知，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，各組精子活率逐漸下降。相對(duì)實(shí)驗(yàn)組而言，5 d后對(duì)照組豬精子活率下降速度最快（P＜0.05），負(fù)壓條件下有利于豬精液的保存。P2、P4組在保存時(shí)間為5～11 d時(shí)的精子活率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；到13 d時(shí)P4組精子活率顯著高于其他組（P＜0.05）。

表1 不同負(fù)壓對(duì)17℃保存豬精子活率的影響

2.2 不同負(fù)壓對(duì)17℃保存豬精子pH的影響 由表2可知，隨著保存天數(shù)的延長(zhǎng)，豬精液的pH逐漸下降。P4和P8組精液的pH從保存第7天開(kāi)始，均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；第13天時(shí)各實(shí)驗(yàn)組pH均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；而7 d后各實(shí)驗(yàn)組的pH差異均不顯著（P＞0.05）。

2.3 不同負(fù)壓對(duì)17℃保存豬精子T-AOC活性影響 由表3可知，各組精子的T-AOC活性隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。在保存第5天之前，對(duì)照組的精子T-AOC活性與P2組無(wú)顯著差異（P＞0.05）；在3～9 d時(shí)P4、P8組T-AOC顯著高于其他2組（P＜0.05）。不同負(fù)壓處理組（P4組與P8組）比對(duì)照組表現(xiàn)出更高的抗氧化能力。因此，適當(dāng)?shù)呢?fù)壓有助于維持公豬精子的抗氧化能力。

表2 不同負(fù)壓對(duì)17℃保存豬精液pH的影響

表3 不同負(fù)壓對(duì)17℃保存豬精子的T-AOC的影響

2.4 不同負(fù)壓對(duì)17℃保存精液中H2O2含量的影響 由表4可知，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，各組精液中H2O2含量逐漸上升；保存1 d時(shí)4組精液中H2O2含量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。保存5～13 d，對(duì)照組精液中H2O2含量顯著高于3個(gè)負(fù)壓處理組（P＜0.05），P4和P8組之間沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。

表4 不同負(fù)壓對(duì)17℃保存精液中 H2O2 含量的影響 μmol/L

3 討 論

3.1 不同負(fù)壓對(duì)17℃保存豬精子活率的影響 精子活率是評(píng)測(cè)精子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，精子活率的高低直接影響著受孕率的高低[6]。精液pH可間接反映精子活率的好壞。Casali等[4]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)負(fù)壓處理可提高綿羊精液質(zhì)量和受精率。在豬的附睪中豬精子長(zhǎng)期處于一種低氧高滲透壓的環(huán)境，使得豬精子處于一種半休眠狀態(tài)，新陳代謝較低[7]。在進(jìn)行豬的人工授精時(shí)要求豬精液的活率應(yīng)不低于60%。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，處于負(fù)壓狀態(tài)下的豬精液其精子活率優(yōu)于常壓環(huán)境，以精子活率不低于60%標(biāo)準(zhǔn)，負(fù)0.04 Mpa和負(fù)0.08 Mpa條件下的精子活率要優(yōu)于常壓條件，所以應(yīng)用適宜的負(fù)壓能提高精子活率。

3.2 不同負(fù)壓對(duì)17℃保存豬精子pH的影響 包宋權(quán)等[8]發(fā)現(xiàn)，在豬精液的保存過(guò)程中不可避免地會(huì)受到細(xì)菌以及自身新陳代謝的影響，從而導(dǎo)致豬精液的質(zhì)量和pH下降。許多研究表明，長(zhǎng)期保存公豬精子需要降低其代謝活性，這主要通過(guò)適當(dāng)?shù)南♂寗┫♂屢约皩囟冉抵?5～17℃來(lái)實(shí)現(xiàn)[9]。本實(shí)驗(yàn)中在負(fù)壓保存的豬精液pH要優(yōu)于常壓，這可能是負(fù)壓環(huán)境會(huì)導(dǎo)致精子的新陳代謝降低，將在下一步的實(shí)驗(yàn)中予以探究。普遍認(rèn)為在豬精液的保存過(guò)程中，豬精液pH是先降低后升高最后趨于穩(wěn)定[11]。本實(shí)驗(yàn)中，豬精液pH不管是常壓下還是負(fù)壓下都一直在下降，這可能與檢測(cè)時(shí)間以及實(shí)驗(yàn)操作有關(guān)，將需進(jìn)一步探究。本實(shí)驗(yàn)中，在負(fù)壓保存下的豬精液pH下降程度要優(yōu)于常壓，與Casali等[4]通過(guò)負(fù)壓處理提高了綿羊精液質(zhì)量基本一致，但其作用機(jī)理還有待進(jìn)一步的探究。

3.3 不同負(fù)壓對(duì)17℃保存豬精子T-AOC活性及精液中H2O2含量影響 氧化應(yīng)激被認(rèn)為是導(dǎo)致精液質(zhì)量變差的最重要的因素之一[12]，T-AOC是反映精子抗氧化能力指標(biāo)之一。在本實(shí)驗(yàn)中，負(fù)壓處理組較對(duì)照組表現(xiàn)出更高的抗氧化能力。在精液保存過(guò)程中，精液中活性氧（ROS）的產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致精子細(xì)胞成分的氧化損傷，即超氧陰離子自由基（O2-）、H2O2和脂質(zhì)過(guò)氧化物，這是精子質(zhì)量下降的主要原因[13]。為了減少ROS在保存精液中對(duì)精子質(zhì)量的有害作用，通常需要在精液中添加抗氧化劑[14]。本實(shí)驗(yàn)中，適宜的負(fù)壓能降低精液中H2O2的含量，這與添加抗氧化劑的作用相同，并且適當(dāng)?shù)呢?fù)壓可以通過(guò)降低精子代謝產(chǎn)生H2O2來(lái)改善精子的活率。在后續(xù)研究中，將在適當(dāng)?shù)呢?fù)壓條件下添加抗氧化劑以進(jìn)一步改善公豬精液保存質(zhì)量。

4 結(jié) 論

在本實(shí)驗(yàn)條件下，在豬精液常溫保存中合適的負(fù)壓可以提高豬精子活率、減少精子的呼吸代謝和降低氧化應(yīng)激，建議最佳保存負(fù)壓為負(fù)0.04 MPa。