周 晶，柳海星，李鐘淑，方南洙

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延邊 133000）

活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）是指在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)由氧構(gòu)成且活性高的一類化合物的總稱，其中最主要含氧自由基為超氧陰離子（O2-）、過(guò)氧化氫（H2O2）、羥自由基（OH）[1]。H2O2是最常見的ROS物質(zhì)，它在生物體內(nèi)的來(lái)源主要是O2-的歧化反應(yīng)。生理水平的ROS在生物體的各種信號(hào)反應(yīng)中充當(dāng)信使，如細(xì)胞增殖、分化和內(nèi)源基因的表達(dá)等[2]。然而，當(dāng)ROS生成量超過(guò)機(jī)體調(diào)控指標(biāo)時(shí)，就會(huì)使細(xì)胞中蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA等大分子過(guò)度氧化，進(jìn)一步威脅到生物體內(nèi)各種生理生化反應(yīng)的進(jìn)行。

胚胎在母體發(fā)育過(guò)程中，因受到氧化-還原機(jī)制的保護(hù)[3]，幾乎不出現(xiàn)發(fā)育阻滯現(xiàn)象。一旦離開妊娠母體，胚胎的有氧代謝就會(huì)加強(qiáng)，同時(shí)又缺乏體內(nèi)抗氧化酶的中和，細(xì)胞的氧化-還原系統(tǒng)會(huì)發(fā)生紊亂，這些擾亂胚胎正常發(fā)育的氧化現(xiàn)象統(tǒng)稱為氧化應(yīng)激（Oxidative Stress，OS）[4]。Nrf2信號(hào)通路是細(xì)胞抵御OS的重要防御機(jī)制，其調(diào)控的下游抗氧化酶在細(xì)胞防御中發(fā)揮重要作用[5]。Nrf2通路主要包括過(guò)氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化基因[6]。同時(shí)，Nrf2因子被認(rèn)為是防止細(xì)胞或組織受ROS影響而引起損傷的一個(gè)關(guān)鍵的防護(hù)因子，如高濃度的ROS誘發(fā)細(xì)胞核內(nèi)Nrf2的積累以及Nrf2通路的激活，從而提高細(xì)胞內(nèi)部抗氧化酶的活性以達(dá)到全面清除ROS的效果[7]。

甘氨酸（Glycine，Gly）是一種抗氧化劑，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞保護(hù)等作用[8-9]。Gly可在細(xì)胞、器官和整體水平上杜絕有害物質(zhì)對(duì)細(xì)胞造成損傷[10]，包括ROS的氧化作用。有實(shí)驗(yàn)表明，培養(yǎng)液中添加抗氧化劑能有效克服胚胎發(fā)育阻滯[11]。但是，Gly對(duì)氧化應(yīng)激小鼠胚胎的作用及機(jī)理未被闡明，對(duì)此，本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞和分子水平上研究Gly對(duì)小鼠胚胎抗氧化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為健康且性成熟的昆明系雌性小白鼠，購(gòu)自延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠均飼養(yǎng)在24℃環(huán)境中，光照周期為12 h（08:00—20:00），黑暗周期為12 h（20:00—08:00）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 孕馬血清促性腺激素（PMSG）和人絨毛膜促性腺激素（hCG）購(gòu)買于寧波激素有限公司；Gly（貨號(hào)：ST085）購(gòu)買于碧云天公司；Qiagen RNeasy Mini Kit試劑盒購(gòu)買于德國(guó)QIAGEN公司；PrimeScript? RT Master Mix試劑盒購(gòu)買于大連寶生物工程有限公司；2×Taq PCR Master Mix購(gòu)買于天根生化科技有限公司；其他相關(guān)藥品非特殊說(shuō)明均購(gòu)自Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 超數(shù)排卵 實(shí)驗(yàn)采用PMSG-hCG法對(duì)小鼠進(jìn)行超數(shù)排卵處理，即將挑選健康、6～8周齡的雌性小鼠于第1天腹腔注射10 IU PMSG，48 h后再腹腔注射10 IU hCG，然后與成年公鼠進(jìn)行1對(duì)1合籠交配，合籠15 h后檢查陰道栓。

1.2.2 胚胎的收集及培養(yǎng) 在注射hCG 20～22 h，采用脫頸法處死見栓母鼠，在無(wú)菌條件下取出胚胎并放入透明質(zhì)酸酶中脫去卵丘顆粒細(xì)胞。4 min后用M16培養(yǎng)液清洗3遍，然后轉(zhuǎn)移到相應(yīng)培養(yǎng)小滴中，在飽和濕度、5% CO2氣相條件、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、孵育。

1.2.3 Gly濃度的篩選 1-cell胚胎于0、1、4、7、10 mmol/L Gly培養(yǎng)液中孵育，分別在24、48、96 h觀察胚胎的發(fā)育情況并記錄下卵裂率、4-cell和囊胚的發(fā)育率，以篩選出利于胚胎發(fā)育的最佳Gly濃度。

1.2.4 胚胎氧化應(yīng)激模型的建立 胡德寶等[12]研究表明，H2O2引起OS的有效致死濃度為25 μmol/L。因此，本實(shí)驗(yàn)采用25 μmol/L H2O2建立氧化應(yīng)激模型。將收集的胚胎置于25 μmol/L的H2O2中孵育30 min后，分別在M16培養(yǎng)液和最佳濃度Gly的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，未經(jīng)H2O2處理的胚胎作為對(duì)照組。

1.2.5 胚胎內(nèi)部ROS水平的檢測(cè) 囊胚期胚胎置于

1 mg/mL PVA小滴中洗滌3遍，然后避光置于10 μmol/L的DCHFDA染色液微滴中在培養(yǎng)箱內(nèi)染色15 min；將染色后的囊胚用PVA清洗3遍，再分別放入一小滴M16中，于熒光顯微鏡下進(jìn)行波長(zhǎng)為535 nm的藍(lán)色熒光激發(fā)，顯色2 min后拍照。用Image J 1.49對(duì)熒光圖片量化分析，結(jié)果用平均熒光強(qiáng)度相對(duì)值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.6 總RNA提取及cDNA合成 培養(yǎng) 96 h后收集囊胚期胚胎17個(gè)（置于-80℃儲(chǔ)存），胚胎總RNA提取根據(jù)Qiagen RNeasy Mini Kit試劑盒用法說(shuō)明進(jìn)行操作。總RNA提取后，根據(jù)PrimeScript? RT Master Mix試劑盒用法說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成的cDNA保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 巢式 PCR 應(yīng)用 2×Taq PCR MasterMix 進(jìn)行 12.5 μL體系的巢式PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：模板2 μL，5 μmol/L上、下 游引物（表 1）各 1 μL，2×Taq PCR Master Mix 6.5 μL，ddH2O22 μL。反應(yīng)程序：第1次PCR 95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃聚合30 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。第2次PCR 95℃ 預(yù)變性 3 min；95℃ 變性 30 s，57℃ 退火 30 s，72℃聚合30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。5 μL的PCR產(chǎn)物應(yīng)用于1%瓊脂糖凝膠電泳，隨后用LANE 1D Analysis Software進(jìn)行IOD值分析。1.3統(tǒng)計(jì)分析 每組數(shù)據(jù)至少重復(fù)3～5次。數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0一般線性模型的單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，P＞0.05為差異不顯著。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度Gly對(duì)小鼠胚胎發(fā)育的影響 從表2可知，各組間的卵裂率無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；4 mmol/L Gly處理組4-cell發(fā)育率顯著高于10 mmol/L處理組（P＜0.05），與其他各組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；4 mmol/L Gly處理組囊胚發(fā)育率顯著高于其他組（P＜0.05），其余各組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。由此可見，4 mmol/L Gly能有效提高胚胎發(fā)育率。

2.2 Gly對(duì)氧化應(yīng)激小鼠胚胎的影響 從表3可知，H2O2+Gly處理組的4-cell發(fā)育率極顯著高于H2O2組（P＜0.01），其囊胚的發(fā)育水平顯著高于H2O2組（P＜0.05）；各處理組的卵裂率無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。2.3 Gly對(duì)囊胚期胚胎ROS水平的影響 如圖1所示，對(duì)照組和H2O2+Gly處理組ROS熒光強(qiáng)度分別極顯著（P＜0.01）和顯著（P＜0.05）低于H2O2處理組，而對(duì)照組與H2O2+Gly處理組沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。2.4 Gly對(duì)胚胎內(nèi)源性抗氧化酶表達(dá)的影響 由圖2可知，Gly能顯著提高CAT（P＜0.05）和SOD1（P＜0.01）基因的表達(dá)水平，但對(duì)SOD2基因的表達(dá)無(wú)影響（P＞0.05）。

3 討 論

圖1 囊胚ROS熒光染色圖（A）及其定量分析圖(B)

臨床研究表明，補(bǔ)充Gly可以潛在地改善健康指標(biāo)、協(xié)助控制代謝和預(yù)防各種疾病的發(fā)生[13]。高濃度Gly能幫助胚胎克服滲透壓，進(jìn)而有利于胚胎在體外的發(fā)育[14]。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于小鼠胚胎來(lái)說(shuō)，4 mmol/L Gly才能有效提高其在體外培養(yǎng)中的發(fā)育率。氨基酸作為一種滲透物時(shí)具有抗氧化作用，通過(guò)降低滲透壓來(lái)保護(hù)分裂階段的胚胎免受ROS損傷，并改善植入前小鼠胚胎的發(fā)育[15]。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4 mmol/L Gly處理不能顯著提高4-cell發(fā)育率，而只對(duì)囊胚發(fā)育率有顯著性影響。因此證明，4 mmol/L Gly對(duì)小鼠胚胎的抗氧化作用主要體現(xiàn)在囊胚時(shí)期。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，Gly的抗氧化作用需要其他物質(zhì)的協(xié)同才能更有效，如Tomomi等[16]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖和Gly協(xié)同作用可提高豬囊胚在體外的發(fā)育率，胚胎的孵化數(shù)量較不添加或只添加Gly時(shí)顯著增加。本實(shí)驗(yàn)中M16培養(yǎng)液只含有葡萄糖成分，Gly+H2O2處理組的小鼠胚胎4-cell發(fā)育率和囊胚發(fā)育率顯著高于H2O2處理組，這與上述研究結(jié)果一致。

表2 Gly對(duì)小鼠合子期胚胎發(fā)育的影響

表3 Gly對(duì)氧化應(yīng)激小鼠胚胎的影響

圖2 囊胚期胚胎抗氧化酶基因表達(dá)的PCR圖（A）及其定量分析圖（B）

實(shí)際上，胚胎在體外的生存環(huán)境很難與體內(nèi)環(huán)境相同，同時(shí)胚胎的抗氧化能力也有一定限度，所以減少胚胎受到的OS十分關(guān)鍵。機(jī)體的OS反應(yīng)多是由于體內(nèi)ROS水平升高而造成的，而H2O2是引起ROS水平上升的主要自由基之一[17]。本實(shí)驗(yàn)在H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)Gly能明顯阻止H2O2導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，并改善小鼠胚胎發(fā)育到囊胚階段的阻滯現(xiàn)象，這進(jìn)一步證明了Gly可減緩胚胎在體外發(fā)育時(shí)受到OS。

胚胎內(nèi)的ROS水平是由機(jī)體氧化-還原平衡和CAT、SOD等抗氧化酶來(lái)一起調(diào)控的[18]。當(dāng)胚胎自身受到OS時(shí)，會(huì)激活Nrf2抗氧化通路。其中，Nrf2是細(xì)胞防御OS反應(yīng)的關(guān)鍵因子，其在保護(hù)細(xì)胞免受氧化和親電子應(yīng)激中起重要作用[19]。在生理?xiàng)l件下，Nrf2處于細(xì)胞質(zhì)中，逐漸被蛋白酶體等降解，只有當(dāng)ROS激增即受到OS時(shí)，Nrf2的降解才被停止并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)。在核內(nèi)，Nrf2會(huì)調(diào)節(jié)啟動(dòng)子區(qū)域的抗氧化基因轉(zhuǎn)錄并表達(dá)。例如，斑馬魚胚胎內(nèi)ROS劇增時(shí)，會(huì)引起Nrf2活動(dòng)的啟停，過(guò)程中伴隨一系列抗氧化酶活性增強(qiáng)[20]。本實(shí)驗(yàn)中，Gly能顯著上調(diào)CAT和SOD1抗氧化基因的表達(dá)，但是對(duì)SOD2基因的表達(dá)無(wú)影響。由此得知，Gly可能通過(guò)上述Nrf2機(jī)制來(lái)提高小鼠胚胎的抗氧化能力。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了Gly能夠有效地清除胚胎發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)量ROS，進(jìn)一步推斷Gly對(duì)小鼠胚胎體外發(fā)育具有抗氧化作用。