邊艷杰，韓金汾，段江燕

(山西師范大學(xué) 生物化學(xué)教研室，山西 臨汾 041004)

MicroRNA(miRNA)是一類單鏈非編碼RNA分子，成熟的miRNA含有19～25個(gè)核苷酸，是由具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體加工而成。在動(dòng)物體內(nèi)，miRNA調(diào)控基因的表達(dá)主要通過與其靶mRNA 3′UTR序列互補(bǔ)結(jié)合抑制其翻譯或特異性切割靶mRNA使其降解來實(shí)現(xiàn)。 作為體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，miRNA幾乎在所有的生物學(xué)過程中都發(fā)揮著重要作用，如發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡和分化[1]。miR-200家族主要由miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-429和miR-141組成，根據(jù)它們?cè)谌旧w上位置的不同，miR-200的家族成員分為miR-200b/a/429簇與miR-200c/141簇。

乳腺是哺乳動(dòng)物體內(nèi)唯一反復(fù)進(jìn)行多次發(fā)育與退化的重要器官，乳腺的發(fā)育與泌乳除受到細(xì)胞因子、激素等調(diào)控外，miRNA的異常表達(dá)也會(huì)對(duì)泌乳功能造成重要的影響[2-5]。雖然目前關(guān)于miRNA在乳腺中的研究已有一些報(bào)道，但是對(duì)一些泌乳調(diào)控中重要功能性miRNA的挖掘仍然非常有限。Wang等[6]研究發(fā)現(xiàn)，miR-152能介導(dǎo)甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1的表達(dá)促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖及泌乳。Bian等[7]報(bào)道顯示，miR-29s參與調(diào)控乳腺泌乳主要通過靶控甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3a及DNMT3b的表達(dá)。金晶等[8]通過small RNA測序發(fā)現(xiàn)，miR-200b在不同乳品質(zhì)的奶牛乳腺中的表達(dá)量差異顯著，推測其可能參與奶牛乳腺乳成分合成的調(diào)控。張犁蘋等[9]研究發(fā)現(xiàn)，與干奶期乳腺組織相比，奶山羊泌乳中期miR-200家族的表達(dá)量顯著增加，推測其在乳蛋白、乳脂的合成中也具有重要的調(diào)控作用。目前，關(guān)于miR-200家族成員的生物學(xué)功能研究報(bào)道，主要集中在腫瘤進(jìn)程調(diào)節(jié)方面[10-11]，而在乳腺泌乳調(diào)控中的研究還不曾報(bào)道。鑒于此，以奶牛乳腺上皮細(xì)胞系作為體外細(xì)胞模型，通過細(xì)胞中過表達(dá)miR-200b，探討其對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳能力的影響，以期為我國奶業(yè)乳品質(zhì)量的優(yōu)化提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用的中國荷斯坦奶牛均為泌乳期奶牛，選自黑龍江畜牧業(yè)科技園區(qū)，具有相近的遺傳背景、胎次和產(chǎn)奶量。依據(jù)產(chǎn)乳品質(zhì)的不同將6頭試驗(yàn)?zāi)膛澐殖筛呷槠焚|(zhì)H組和低乳品質(zhì)L組(每試驗(yàn)組3頭)。高乳品質(zhì)H組：平均乳蛋白率(3.27±0.04)%、乳糖含量(4.84±0.03)%、平均乳脂率(4.17±0.01)%；低乳品質(zhì)L組：平均乳蛋白率(2.89±0.02)%、乳糖含量(4.52±0.09)%、平均乳脂率(3.20±0.06)%。取乳腺深層組織，每塊組織體積均勻，約為1 cm3，用生理鹽水(含0.01% DEPC，已滅菌)進(jìn)行清洗，后用于細(xì)胞培養(yǎng)。

Trizol、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自Invitrogen公司，Hairpin-itTMmiRNAs qPCR Quantitation Kit(miR-200b、內(nèi)參5S rRNA)及siRNA-Mate轉(zhuǎn)染試劑購自上海吉瑪生物技術(shù)公司，miR-200b mimics及陰性對(duì)照Scr購自韓國Bioneer公司，DMEM/F12以及胎牛血清購自Gibco公司，Lactose/D-Galactose(Rapid) Assay Kit購自Megazyme公司，PrimeScriptTMRT Reagent Kit、SYBR Premix ExTaqTM試劑盒購自TaKaRa公司，甘油三酯定量檢測試劑盒購自普利萊基因技術(shù)公司，β-酪蛋白(CSN2)檢測試劑盒購自Uscn Life Science公司，細(xì)胞培養(yǎng)皿購自康寧公司，Cell-LightTMEdU Apollo1567 In Vitro Imaging Kit購自廣州RiBoBio公司，NaCl等其他常用試劑為國產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 TaqMan qRT-PCR檢測miR-200b在不同產(chǎn)乳品質(zhì)奶牛乳腺組織中的表達(dá)

添加液氮，將乳腺組織研成粉末，收集至RNase-Free EP管中，加入1 mL Trizol，劇烈振蕩，室溫孵育10 min，然后加入0.2 mL氯仿，混勻15 s后靜置孵育3 min，于4 ℃、12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，吸取上層水相至新EP管中，加0.5 mL異丙醇(-20 ℃預(yù)冷)，輕輕混勻后，靜置孵育10 min，12 000 r/min離心10 min，收取沉淀，并用75%乙醇洗滌，7 500 r/min離心15 min后，倒掉75%的乙醇，用濾紙蘸去多余水分，風(fēng)干沉淀，用RNase-Free水溶解沉淀，瓊脂糖凝膠電泳檢測獲取的RNA質(zhì)量。將提取的完整的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR檢測，具體操作參照MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶及Hairpin-itTMmiRNAs qPCR Quantitation Kit操作說明書，PCR反應(yīng)結(jié)束后，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算miR-200b在各組樣品中的相對(duì)表達(dá)量[12]。

1.3 miR-200b mimics轉(zhuǎn)染奶牛乳腺上皮細(xì)胞

本試驗(yàn)中奶牛乳腺上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)采用組織塊法，胰酶消化法進(jìn)行后期上皮細(xì)胞的純化，將純化后的乳腺上皮細(xì)胞接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液為含10%血清的DMEM/F12，細(xì)胞于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取濃度約為5×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液進(jìn)行接種，待培養(yǎng)板中細(xì)胞密度為80%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。取DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基(不含雙抗及血清)95 μL，滴加siRNA-Mate轉(zhuǎn)染試劑5 μL，輕輕混勻，室溫孵育5 min，加入miR-200b mimics及陰性對(duì)照Scr，其終濃度為100 nmol/L，混勻后靜置10 min?？瞻讓?duì)照組(Mock)只滴加siRNA-Mate試劑。轉(zhuǎn)染6 h后，熒光顯微鏡分析細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，若轉(zhuǎn)染效率滿足試驗(yàn)要求，用含10%血清的DMEM/F12繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞樣品，Trizol法提取總RNA，qRT-PCR檢測miR-200b的表達(dá)。

1.4 miR-200b靶基因的生物信息學(xué)預(yù)測

通過生物信息學(xué)軟件，對(duì)miR-200b可能的靶基因進(jìn)行在線預(yù)測，根據(jù)TargetScan(http://www. targetscan.org/)及miRanda (http://www.microrna.org/)網(wǎng)站提供的miR-200b靶基因預(yù)測相關(guān)數(shù)據(jù)，篩選出與奶牛乳腺發(fā)育及泌乳相關(guān)的重要功能調(diào)控基因。通過分析TargetScan 7.2得到的數(shù)據(jù)，明確miR-200b與其靶基因可能結(jié)合的調(diào)控位點(diǎn)。

1.5 miR-200b過表達(dá)對(duì)預(yù)測靶基因及泌乳相關(guān)功能基因mRNA表達(dá)的影響

轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照Scr及miR-200b mimics 48 h后，Trizol法提取總RNA，qRT-PCR檢測miR-200b過表達(dá)組及對(duì)照組中預(yù)測的miR-200b靶基因的表達(dá)量，同時(shí)檢測對(duì)乳成分合成功能基因Akt、Csn2、Srebp1、Glut1 mRNA表達(dá)的影響，具體操作步驟參照文獻(xiàn)[7]。β-actin為內(nèi)參基因，結(jié)果用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。試驗(yàn)中所涉及引物由華大基因公司合成，相關(guān)序列見表1。

1.6 miR-200b過表達(dá)對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞活力及增殖的影響

轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照Scr及miR-200b mimics 96 h后，應(yīng)用CASY細(xì)胞分析儀(Sch?rfe System，德國)檢測miR-200b對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞活力的影響。胰酶消化細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，吸取待測細(xì)胞樣品，將其加入10 mL的等電壓電解質(zhì)溶液CASY-TON中，運(yùn)行分析儀器，將檢測結(jié)果存為活細(xì)胞數(shù)據(jù)。吸取單細(xì)胞懸液200 μL，加入600 μL乙醇，輕輕混勻，靜置約6 min，確保細(xì)胞完全死亡，加入10 mL的CASY-TON，混勻后運(yùn)行儀器進(jìn)行檢測，將檢測結(jié)果存為死細(xì)胞數(shù)據(jù)，并進(jìn)行活細(xì)胞與死細(xì)胞圖像疊加，將二者交叉處所對(duì)應(yīng)的X軸數(shù)值設(shè)定為標(biāo)線位置。吸取100 μL的單細(xì)胞懸液加入10 mL的CASY-TON，充分混勻后置于分析儀器外部的電極處，檢測各組細(xì)胞活力的變化。參照文獻(xiàn)[7]，應(yīng)用5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(EdU)標(biāo)記法，檢測轉(zhuǎn)染miR-200b mimics 96 h后處于增殖期的奶牛乳腺上皮細(xì)胞，激光共聚焦觀察細(xì)胞，結(jié)果用Image Pro-Plus 6.0軟件進(jìn)行圖片分析，算出S期細(xì)胞百分比，判斷細(xì)胞的增殖情況。

表1 miR-200b預(yù)測靶基因及乳成分合成相關(guān)

1.7 miR-200b過表達(dá)后奶牛乳腺上皮細(xì)胞分泌β-酪蛋白、乳糖及甘油三酯的測定

miR-200b mimics及陰性對(duì)照Scr轉(zhuǎn)染奶牛乳腺上皮細(xì)胞 96 h，取細(xì)胞培養(yǎng)液，分別于450 nm和550 nm處檢測各組培養(yǎng)液中β-酪蛋白和甘油三酯的含量；烘干法對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行濃縮處理，于450 nm處測定培養(yǎng)液中乳糖的含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

SPSS 13.0進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用t檢驗(yàn)分析各試驗(yàn)組的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-200b在不同產(chǎn)乳品質(zhì)奶牛乳腺組織中的表達(dá)水平

將5S rRNA cDNA作為內(nèi)參，進(jìn)行qRT-PCR數(shù)據(jù)分析，結(jié)果如圖1所示，與L組相比，miR-200b在H組中的表達(dá)量極顯著上調(diào)，miR-200b在不同產(chǎn)乳品質(zhì)奶牛乳腺組織中差異表達(dá)，推測其可能與奶牛乳腺泌乳調(diào)控相關(guān)。

H：高乳品質(zhì)組； L：低乳品質(zhì)組 **表示處理間差異極顯著(P<0.01)，下同圖1 miR-200b在不同產(chǎn)乳品質(zhì)奶牛乳腺組織中的表達(dá)水平

2.2 miR-200b mimics轉(zhuǎn)染率及過表達(dá)效果檢測

圖2A為純化后的奶牛乳腺上皮細(xì)胞，由圖可知，奶牛乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)均一，細(xì)胞呈現(xiàn)為多邊形鵝卵石樣。將異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的陰性對(duì)照Scr，以及通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)入細(xì)胞的miR-200b mimics，使用熒光顯微鏡觀察，記錄轉(zhuǎn)染6 h后的轉(zhuǎn)入效率。結(jié)果如圖2B所示，在奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)可觀測到較多的綠色熒光，表明轉(zhuǎn)染效果較好。轉(zhuǎn)染miR-200b mimics 48 h后，過表達(dá)組與對(duì)照組相比miR-200b表達(dá)量極顯著升高(圖2C)，表明轉(zhuǎn)染 miR-200b mimics能夠?qū)崿F(xiàn)miR-200b的過表達(dá)。

A：純化的奶牛乳腺上皮細(xì)胞； B：轉(zhuǎn)染FITC標(biāo)記的 miR-200b mimics； C：qRT-PCR檢測miR-200b過表達(dá)效果圖2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞中miR-200b mimics轉(zhuǎn)染效率及miR-200b過表達(dá)效果的檢測

2.3 miR-200b靶基因的生物信息學(xué)預(yù)測

結(jié)合TargetScan與miRanda 靶基因生物學(xué)預(yù)測軟件的分析結(jié)果，通過比較篩選出3個(gè)與奶牛乳腺發(fā)育與泌乳調(diào)控關(guān)系密切的功能基因，分別為Pten、Dnmt3a、Dnmt3b，將這3個(gè)與奶牛乳腺泌乳相關(guān)的功能基因作為miR-200b的預(yù)測靶基因進(jìn)行后續(xù)的研究分析。miR-200b與預(yù)測靶基因3′UTR 結(jié)合情況如表2所示，miR-200b 的7個(gè)種子序列分別與PtenmRNA 3′UTR 2515—2521處、Dnmt3bmRNA 3′UTR 1417—1423處、Dnmt3amRNA 3′UTR 694—700處的堿基序列匹配互補(bǔ)。

表2 miR-200b靶基因預(yù)測結(jié)果

2.4 miR-200b過表達(dá)對(duì)預(yù)測靶基因mRNA表達(dá)的影響

轉(zhuǎn)染48 h后，qRT-PCR檢測預(yù)測的miR-200b靶基因mRNA表達(dá)，結(jié)果見圖3，過表達(dá)miR-200b后PtenmRNA的表達(dá)量與對(duì)照組相比降低了約40%，差異顯著，而miR-200b表達(dá)量上調(diào)對(duì)Dnmt3a與Dnmt3bmRNA水平的影響并不顯著。

*表示差異顯著(P<0.05),下同圖3 miR-200b過表達(dá)對(duì)靶基因mRNA表達(dá)的影響

2.5 miR-200b過表達(dá)對(duì)乳成分合成相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)的影響

圖4結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染48 h后，奶牛乳腺上皮細(xì)胞中乳成分合成相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵基因Akt、Srebp1、Csn2的mRNA表達(dá)量分別上調(diào)了1.9、2.3、3.2倍，與空白對(duì)照組(Mock)和陰性對(duì)照組(Scr)相比差異極顯著。Glut1的mRNA表達(dá)量上調(diào)1.6倍，差異顯著。

圖4 miR-200b過表達(dá)對(duì)乳成分合成相關(guān)功能基因mRNA表達(dá)的影響

2.6 miR-200b過表達(dá)對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞活力與增殖的影響

轉(zhuǎn)染96 h后，CASY分析細(xì)胞活力的變化。結(jié)果如圖5A所示，與對(duì)照組相比，miR-200b過表達(dá)顯著提升了奶牛乳腺上皮細(xì)胞的活力。miR-200b對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響如圖5B所示，轉(zhuǎn)染96 h后，DAPI復(fù)染細(xì)胞核(藍(lán)色熒光)，EdU 標(biāo)記處于增殖期即S期的細(xì)胞(紅色熒光)，DAPI染色與EdU標(biāo)記圖片疊加(Merged)后S期的細(xì)胞顯示為紫色，應(yīng)用Image pro-plus 6.0計(jì)算分析，結(jié)果如圖5C，miR-200b過表達(dá)組奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖率顯著增加。

2.7 miR-200b過表達(dá)對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞分泌β-酪蛋白、乳糖及甘油三酯的影響

轉(zhuǎn)染96 h后，培養(yǎng)液中分泌的β-酪蛋白含量檢測結(jié)果如圖6A所示，miR-200b過表達(dá)組與對(duì)照組相比，β-酪蛋白的分泌量極顯著提高；甘油三酯含量檢測結(jié)果如圖6B所示，與對(duì)照組相比，miR-200b上調(diào)后胞外甘油三酯的分泌量極顯著升高；乳糖含量檢測結(jié)果見圖6C，與對(duì)照組相比，miR-200b的過表達(dá)能極顯著促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳糖的分泌。

B：EdU技術(shù)標(biāo)記S期細(xì)胞圖5 miR-200b過表達(dá)對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞活力及增殖的影響

圖6 miR-200b過表達(dá)對(duì)胞外培養(yǎng)液中β-酪蛋白、乳糖及甘油三酯含量的影響

3 結(jié)論與討論

近年來，隨著生活質(zhì)量的不斷提高，人們生活水平有了很大改善，對(duì)乳品的質(zhì)量要求也不斷增加，如何進(jìn)一步優(yōu)化國內(nèi)奶業(yè)乳品質(zhì)、提升乳品產(chǎn)量已成為了當(dāng)下奶業(yè)科研工作者們面臨的重要問題，深入挖掘泌乳生物學(xué)調(diào)控機(jī)制對(duì)于乳品質(zhì)的提升具有重要的指導(dǎo)意義。miRNA作為一類非編碼的小分子RNA，同時(shí)調(diào)控多個(gè)靶mRNA，這類小分子RNA與其靶mRNA構(gòu)成了生物體內(nèi)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，影響著疾病的發(fā)生、細(xì)胞分化、凋亡、增殖、病毒感染以及機(jī)體發(fā)育等一系列重要的生命活動(dòng)進(jìn)程[13-14]，據(jù)報(bào)道，在人體中約1/3基因的表達(dá)受到miRNA調(diào)節(jié)[15]，miRNA表達(dá)發(fā)生異常通常會(huì)引起細(xì)胞調(diào)控的改變。大量的研究表明，miRNA在奶牛乳腺發(fā)育以及泌乳進(jìn)程中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用[16-20]。金晶等[8]通過small RNA測序技術(shù)挖掘了與奶牛乳腺乳成分生成調(diào)控相關(guān)的miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR-200b在高乳品質(zhì)組的表達(dá)量顯著高于低乳品質(zhì)組，本研究利用qRT-PCR進(jìn)行再次驗(yàn)證，結(jié)果與small RNA測序數(shù)據(jù)相符，提示在奶牛乳腺中，miR-200b的生物學(xué)功能可能與乳成分的生成以及泌乳量的調(diào)控密切相關(guān)。

miRNA功能發(fā)揮主要通過介導(dǎo)其靶基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)，本研究通過生物信息學(xué)軟件分析，篩選出與奶牛乳腺泌乳密切相關(guān)功能基因，分別為Pten、Dnmt3a、Dnmt3b，將這3個(gè)功能基因作為miR-200b可能的靶基因進(jìn)行后續(xù)的研究分析。通過在線軟件，找到miR-200b與預(yù)測靶基因Pten、Dnmt3a、Dnmt3b潛在的結(jié)合位點(diǎn)。其中，Pten作為腫瘤中常見的非活性蛋白，主要介導(dǎo)PI3K-AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)，進(jìn)而參與細(xì)胞增殖、凋亡、生長及轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)[21-23]。近期有研究認(rèn)為，PTEN-AKT通路能夠誘導(dǎo)催乳素的分泌而參與泌乳調(diào)節(jié)的啟動(dòng)[24]。Wang等[25]研究也證實(shí)在奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳過程中，Pten基因可靶向負(fù)調(diào)控PI3K-AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響Akt、CyclinD1、S6k1、4Ebp1、Stat5、Csn2、Srebp1、mTOR、Pparγ、Glut1的表達(dá)，進(jìn)而參與細(xì)胞的生長與泌乳的調(diào)節(jié)。DNMT3a與DNMT3b作為DNA甲基化過程中重要的酶類，主要參與生物體的發(fā)育調(diào)節(jié)，已有報(bào)道表明，DNMT3a與DNMT3b能夠介導(dǎo)乳成分合成相關(guān)信號(hào)通路基因啟動(dòng)子的甲基化來影響乳腺發(fā)育與泌乳[7]。為了驗(yàn)證本研究中生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果，在過表達(dá)miR-200b后，檢測了細(xì)胞中其可能的靶基因Pten、Dnmt3a、Dnmt3bmRNA表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，miR-200b上調(diào)能夠顯著抑制PtenmRNA的表達(dá)，而對(duì)Dnmt3a、Dnmt3bmRNA水平影響不顯著。由于條件的限制，未能完成miR-200b對(duì)DNMT3a與DNMT3b蛋白水平表達(dá)影響的檢測，但已有的數(shù)據(jù)表明，miR-200b能夠通過直接調(diào)控PtenmRNA的表達(dá)參與乳腺泌乳功能調(diào)節(jié)。

一些泌乳重要功能基因的表達(dá)對(duì)于乳腺泌乳能力的調(diào)節(jié)至關(guān)重要，Akt是奶牛乳腺泌乳進(jìn)程中重要的應(yīng)答因子，它能夠被一系列激素或生長因子所激活，在乳腺細(xì)胞增殖、乳成分合成、分泌及代謝調(diào)控中扮演著重要角色[26]。Akt介導(dǎo)的信號(hào)通路在Pten調(diào)節(jié)的細(xì)胞增殖、凋亡與代謝中有著重要的地位，在小鼠乳腺上皮細(xì)胞中的研究表明Akt的過表達(dá)或者Pten的缺失都能誘導(dǎo)乳腺細(xì)胞的迅速分裂[27]。SREBP1作為乳脂合成代謝中一個(gè)重要的固醇類調(diào)節(jié)元件，是脂肪合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的決定子，能夠調(diào)節(jié)乳脂合成關(guān)鍵酶的表達(dá)，在脂肪酸的調(diào)控和膽固醇的生成中有著至關(guān)重要的作用[28]。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT1是乳腺上皮細(xì)胞中重要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體，它主要介導(dǎo)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，參與調(diào)節(jié)動(dòng)物乳腺乳糖的合成[29]。奶牛乳腺中β-酪蛋白在具有很強(qiáng)的表達(dá)活性，同時(shí)它也是牛乳中含量最高的酪蛋白。β-酪蛋白的表達(dá)是泌乳能力中乳蛋白合成與分泌的重要衡量指標(biāo)，在乳腺組織中β-酪蛋白調(diào)控能夠指導(dǎo)靶基因的高效表達(dá)[30]。相關(guān)研究顯示，這些泌乳功能基因在Pten介導(dǎo)的泌乳調(diào)節(jié)過程中有著重要的作用[25]，因此，本研究分析了過表達(dá)miR-200b后這些乳合成相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵基因mRNA的變化。結(jié)果顯示，miR-200b過表達(dá)能顯著增加Akt、Srebp1、Csn2、Glut1 mRNA的表達(dá)，與Wang等[25]結(jié)論相吻合，提示miR-200b可能通過介導(dǎo)其靶基因Pten表達(dá)的抑制進(jìn)而促進(jìn)泌乳相關(guān)信號(hào)通路Akt、Srebp1、Csn2、Glut1的表達(dá)。

哺乳動(dòng)物體內(nèi)，乳腺是能夠?qū)Ⅲw內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為食物“奶”的特殊器官，泌乳的發(fā)生也是動(dòng)物進(jìn)化過程中最重要的結(jié)果之一，泌乳進(jìn)程的完成主要經(jīng)歷乳腺組織的發(fā)育、乳汁合成及乳汁分泌等幾個(gè)生物學(xué)階段。泌乳細(xì)胞的活性及數(shù)量對(duì)乳腺的泌乳能力具有決定性的影響，奶牛乳腺上皮細(xì)胞活力及數(shù)量的增加能夠大大提升乳腺的泌乳能力[31]。過表達(dá)miR-200b后，本研究分析了細(xì)胞活力的變化，結(jié)果表明，miR-200b表達(dá)上調(diào)后能顯著提升奶牛乳腺上皮細(xì)胞活力。處于增殖期的細(xì)胞即S期細(xì)胞中正在復(fù)制的DNA分子能夠與EdU結(jié)合而被標(biāo)記，該法也是至今監(jiān)測細(xì)胞增殖最準(zhǔn)確的方法之一。本研究通過EdU標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn)miR-200b過表達(dá)能促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖，研究結(jié)果與Uhlmann等[32]在乳腺癌細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)相符合，其研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞中上調(diào)miR-200bc/429簇后，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1B(p27/Kip1)的表達(dá)降低，細(xì)胞分裂周期25C基因(CDC25C)表達(dá)增加，miR-200b上調(diào)能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖。在HeLa細(xì)胞中，也有報(bào)道稱miR-200b也能通過直接靶控Rho家族GTP酶3(RND3)上調(diào)細(xì)胞周期因子cyclin D1(CCND1)的表達(dá)，在細(xì)胞增殖中具有正調(diào)控作用[33]。這些研究表明，miR-200b可以通過靶控幾種不同的因子在轉(zhuǎn)錄或蛋白質(zhì)水平上參與細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果顯示，miR-200b能夠負(fù)調(diào)控靶基因Pten的表達(dá)，Pten表達(dá)的缺失能夠抑制泌乳相關(guān)功能基因的表達(dá)，進(jìn)而影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖。關(guān)于奶牛乳腺中miR-200b的過表達(dá)能提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞活力并促進(jìn)其增殖的研究也為今后乳腺細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程調(diào)控研究提供了新的參考。

牛奶是人們?nèi)粘Ｉ钪兄匾臓I養(yǎng)來源，其成分主要包括乳蛋白、乳糖及乳脂。乳腺的泌乳質(zhì)量也主要體現(xiàn)在乳汁中乳蛋白、乳脂及乳糖的含量上。在牛乳蛋白中，β-酪蛋白作為乳腺上皮細(xì)胞分泌的一種磷酸蛋白，占總酪蛋白的48%，因此人們常把β-酪蛋白的含量作為鑒定乳蛋白合成能力的重要指標(biāo)[34]。在動(dòng)物體內(nèi)，脂肪多數(shù)以甘油三酯的形式貯存，故甘油三酯的含量也常被用來作為衡量乳腺泌乳能力的重要指標(biāo)。miR-200b過表達(dá)后，奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中分泌的β-酪蛋白、甘油三酯及乳糖的含量均明顯增加，提示miR-200b在奶牛乳腺的泌乳生物學(xué)調(diào)控中具有重要的正調(diào)節(jié)作用，對(duì)我國奶業(yè)乳質(zhì)量改善及乳產(chǎn)量的提升具有重要的理論與生產(chǎn)指導(dǎo)意義。