周會明，張焱珍，柴紅梅，孔令艦，劉芳艷，陸藝嬌，雷啟麗，黃 雯

(1.滇西科技師范學(xué)院 生物技術(shù)與工程學(xué)院，云南 臨滄 677000； 2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南 昆明 650221)

雞瑽菌(Termitomyces)隸屬于真菌界、擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、口蘑科，是一類具有較高營養(yǎng)價值和藥用價值且極為稀少的野生食用菌[1-2]。國內(nèi)外關(guān)于雞瑽菌的研究已長達200多年[3]，主要集中于營養(yǎng)分析[4]、液體發(fā)酵[5]、產(chǎn)品貯藏[6]、產(chǎn)品工藝[7]、活性成分測定[8]、與白蟻的共生關(guān)系[9-12]等方面，而針對雞瑽菌的遺傳多樣性分析較少[13]。

在《菌物索引》收錄的69個雞瑽菌名稱中，我國有24個種類，其中，四川有9種，貴州有8種，廣東有4種，其他省區(qū)僅有1～2種，云南達20種[14-15]。雞瑽菌是云南省臨滄市野生菌主打產(chǎn)品，但隨著市場需求日益增加，當(dāng)?shù)刈匀簧鷳B(tài)系統(tǒng)的嚴重破壞，以及過度采摘，導(dǎo)致該菌的野生資源遭到了嚴重破壞，因此，針對雞瑽菌進行遺傳多樣性研究在資源保護與可持續(xù)利用方面具有重要的意義[13]。除了雞瑽菌形態(tài)特征分析，在近緣種分析方面，真菌核糖體DNA序列系統(tǒng)分析被較多的研究者采用[16-17]，對最適培養(yǎng)基的篩選又可了解雞瑽菌的生長發(fā)育特點，為其人工保育打下基礎(chǔ)。

本研究以臨滄市各地搜集的雞瑽菌為材料，借助rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)分子標記技術(shù)，明確當(dāng)?shù)氐碾u瑽菌類別，并從營養(yǎng)學(xué)的角度初步篩選最適菌株及其培養(yǎng)基，為該菌種的資源保護和開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

從臨滄市各地采集13個雞瑽菌菌株(表1)樣品，經(jīng)組織分離得到純化菌株，作為本試驗供試材料。ITS序列系統(tǒng)分析共采用38個序列片段，其中25個來自于GenBank。

1.2 菌株培養(yǎng)及DNA提取

接種少量菌絲體到5mL YPD(0.2%蛋白胨、0.2%酵母粉、2%葡萄糖、1.5%瓊脂粉，pH值自然)液體培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)2周。取菌絲體置于2 mL離心管中，液氮冷凍條件下研磨至粉末狀，使用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法抽提DNA，然后用0.8%瓊脂糖檢測DNA的質(zhì)量和濃度[18]。

1.3 PCR擴增及序列測定

以引物NS1(5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′)和NS4(5′-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3′)擴增18S nrDNA片段，以引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)擴增ITS片段。50 μL反應(yīng)體系包括：2×PowerTaqPCR MasterMix 25 μL(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)、10 μmol/L引物2 μL、DNA模板1 μL，無菌去離子水補足50 μL。擴增在BIO-RAD公司的C1000TMThermal Cycler PCR擴增儀上進行，擴增程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，符合預(yù)測的樣品進行雙向測序。本試驗所用引物的合成及PCR產(chǎn)物序列測定均在北京三博遠志生物技術(shù)責(zé)任有限公司完成。

表1 供試雞瑽菌菌株及DNA序列

1.4 序列比對及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

測序后的正反向序列使用DNAStar軟件包中的SeqMan進行拼接。獲得的完整序列用Cluxtal X進行序列比對，去除兩端長短不一及模糊比對的部分，使序列長度基本一致[19]。將比對好的ITS序列轉(zhuǎn)換為nexus格式文件后提交到GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫，通過美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)在線BLAST N檢索進行同源性比較，采用Clustal X軟件對所測序列進行多序列聯(lián)配分析，用MEGA 4.0軟件中最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，計算遺傳距離[20]。

1.5 最優(yōu)菌株篩選

培養(yǎng)基YPD經(jīng)121 ℃滅菌30 min后加入青霉素(10 mg/L)和鏈霉素(10 mg/L)，振蕩搖勻，趁熱倒平板，冷卻。將黃豆大小的菌落接種于平板培養(yǎng)基的中央，每皿1塊，重復(fù)3皿，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)18 d，采用十字交叉法測定菌落直徑，記錄菌絲生長速度及生長勢。

1.6 最適培養(yǎng)基篩選

選擇1.5中生長最優(yōu)菌株，從糞便、谷粒、蔬菜、果類、腐殖土、木屑六方面設(shè)計適合于雞瑽菌生長的培養(yǎng)基配方(表2)。每一配方中均添加20 g葡萄糖、15 g瓊脂、2 g蛋白胨，最后用自來水定容至 1 L，pH值自然，每個配方3個重復(fù)，制作方法同PDA培養(yǎng)基，即稱取各主料后用自來水煮沸10 min，取濾液。121 ℃滅菌30 min后加入青霉素(10 mg/L)和鏈霉素(10 mg/L)，振蕩搖勻，趁熱倒平板，25 ℃黑暗培養(yǎng)29 d，接菌和測定與1.5中方法相同，最終篩選適宜于菌株生長的最優(yōu)培養(yǎng)基。

表2 供試培養(yǎng)基主要成分及含量 g

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞瑽菌ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

ITS序列系統(tǒng)分析過程中，將所測的正反向序列使用DNAStar軟件包中的SeqMan進行拼接、編輯獲得完整ITS序列，以13個雞瑽菌基因序列為基礎(chǔ)，與GenBank中的25個雞瑽菌屬ITS基因序列進行同源性比較，利用Clustal X軟件對所得序列進行多序列聯(lián)配分析，然后進行系統(tǒng)發(fā)育分析。由圖1可知，本試驗所采集供試菌株聚在4個分支內(nèi)，其中以Termitomycesaurantiacus最多，包括7191、4279、4272、4268、4267、4432、5123、5081，其次為Termitomycessymbiont、Termitomyceseurrhizus，以Termitomycesbulborhizus最少。

2.2 最優(yōu)雞瑽菌菌株的篩選

根據(jù)組織分離后菌絲生長情況，選擇菌絲分布均一且長勢較好的8種菌株作為參試對象，結(jié)果顯示，在YPD培養(yǎng)基上不同雞瑽菌株生長情況不同，其中菌株4279生長速度最快[(0.65±0.01)mm/d]且菌絲長勢濃密，與其他處理相比差異達到極顯著水平，隨后依次是2871與2878，而4288在培養(yǎng)基上生長最慢且菌絲生長勢較差(表3、圖2)?？傊?，雞瑽菌菌株在YPD培養(yǎng)基上菌絲體生長速度由大到小依次排列為：4279>2871>2878>2874>4268>4267>2885>4288。

圖1 基于ITS序列的雞瑽菌菌株系統(tǒng)發(fā)育分析(1 000次重復(fù))表3 不同雞瑽菌菌株菌絲生長特性

菌株編號萌發(fā)時間/d生長勢菌落直徑/mm生長速度/(mm/d)28718++19.800.55±0.03bB28747+18.750.52±0.05bBC28788+19.600.54±0.07bB28858++16.030.45±0.01cdD426712+++16.380.46±0.01cdCD42688++16.800.47±0.06cCD42798+++23.500.65±0.01aA428811+15.250.42±0.02dD

注：菌絲生長速度為3次重復(fù)的平均值±標準差。同列數(shù)字后不同小寫字母表示在0.05水平有顯著差異；不同大寫字母表示在0.01水平有極顯著差異，下同。菌絲長勢：濃密用+++表示，較濃密的用++表示，稀疏用+表示。

圖2 不同雞瑽菌菌株的生長速度

2.3 雞瑽菌最適培養(yǎng)基的篩選

在不同培養(yǎng)基上雞瑽菌菌株4279生長情況不同，其中在1號牛糞為主的培養(yǎng)基上生長速度最快[(0.77±0.04)mm/d]且菌絲長勢濃密(表4、圖3)，與其他處理相比差異達到顯著水平，其次是6號蘋果為主的培養(yǎng)基與3號韭菜為主的培養(yǎng)基，而在10號木屑為主培養(yǎng)基上生長最慢且菌絲長勢較差(圖3)。

表4 不同培養(yǎng)基配方對雞瑽菌菌株4279菌絲生長的影響

圖3 不同培養(yǎng)基上雞瑽菌菌株4279菌絲生長情況

3 結(jié)論與討論

雞瑽菌作為一種天然綠色、營養(yǎng)健康的食品[21-22]，深受廣大消費者的青睞，但其人工馴化栽培至今尚未成功[14]，如今，在外界各種不利因素下，該菌種質(zhì)資源的保護成為眾多相關(guān)研究的首要內(nèi)容。云南雞瑽菌棲息面積不到世界該菌棲息總面積的10%，但種類占全球種類總數(shù)的50%、我國種類總數(shù)的83%[9]，因此，云南本地雞瑽菌遺傳多樣性探究的意義重大。

目前，ITS分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用在研究雞瑽菌種質(zhì)資源方面已經(jīng)成熟，眾多學(xué)者以云南地區(qū)市場上售賣的雞瑽菌為研究對象，發(fā)現(xiàn)雞瑽菌大部分種為云南地區(qū)的地方性物種，云南可能是雞瑽菌新的演化中心[13,15,23-24]，因此，針對云南地方性雞瑽菌進行研究很有必要。

臨滄市作為雞瑽菌生長最多的地方之一，長期以來，因沒有很好的分子特征支持，Termitomyces混合種群的分類一直給相關(guān)科研工作造成諸多不便。本研究搜集臨滄市不同地域Termitomyces資源，通過測序獲得ITS序列，結(jié)合GenBank已有的序列特征，系統(tǒng)分析不同來源及不同命名的菌株之間的親緣關(guān)系，并從生物學(xué)種分類的角度進行了較好的確認。從得到的系統(tǒng)進化樹來看，ITS序列作為變異較大的區(qū)域，較好地反映了菌株的聚類特征。所采集供試菌株聚在4個分支內(nèi)，其中以Termitomycesaurantiacus最多，隨后依次為Termitomycessymbiont、Termitomyceseurrhizus，以Termitomycesbulborhizus最少。同時，試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在YPD培養(yǎng)基上Termitomycesaurantiacus菌株4279生長速度最快[(0.65±0.01)mm/d]，在1號牛糞為主的培養(yǎng)基上生長速度可達(0.77±0.04)mm/d，且菌絲長勢濃密。

綜上，本研究系統(tǒng)分析了雞瑽菌混合種群的分類地位，同時，通過最優(yōu)菌株和培養(yǎng)基的篩選，為其人工馴化提供理論依據(jù)。但因采集樣本較少，只對當(dāng)?shù)刈顬槌Ｒ姷碾u瑽菌做了初步的探討，在今后的工作中應(yīng)增加樣品的采集范圍與數(shù)量，在ITS分子標記的基礎(chǔ)上，利用其他分子標記技術(shù)，如18S rRNA序列分析、SSR、IGS等對該菌進行深入的研究[25-29]。