付蘇宏，雷 鳴，張勇群，施 靜，郝豆豆

(西藏自治區(qū)人民政府駐成都辦事處醫(yī)院 分子醫(yī)學(xué)實驗室，四川 成都 610041)

菊葉香藜(Dysphaniaschraderiana)為藜科1年生草本植物，具有強烈的刺激性氣味，廣泛生存于青藏高原草甸，此外也生長于海拔2 700～4 500 m的山坡、村邊、河灘等[1]。菊葉香藜生長于輻射強、溫差大的高原環(huán)境中，具有較好的極端環(huán)境耐受力，可用于改善生態(tài)環(huán)境[2]。此外，菊葉香藜具有廣泛的藥理活性，《藏藥志》記載菊葉香藜具有抗腫瘤活性[3]，全草入藥可清熱解毒，用于治療感冒、頭疼、皮膚瘙癢等[4]。菊葉香藜因含有揮發(fā)油而具有強烈的氣味，因此對其精油的研究也日益增多。石夢菲[5]研究發(fā)現(xiàn)，菊葉香藜精油可抑制大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的生長；雷鳴等[6]發(fā)現(xiàn)，菊葉香藜精油可顯著抑制玉米象活力；劉志龍等[7]研究發(fā)現(xiàn)，菊葉香藜精油在防治螨蟲方面具有顯著效果，現(xiàn)已申請專利。石夢菲等[5]利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)對菊葉香藜精油成分進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菊葉香藜精油的主要成分為脂肪族化合物(54.232%)、萜類化合物及其含氧衍生物(31.945%)，其中單萜類化合物和倍半萜類化合物含量較高，主要萜類化合物有α-杜松醇(α-Cadinol，13.966%)、四甲基環(huán)癸二烯甲醇(Hedycaryol，11.164%)和δ-杜松烯(δ-Cadinene，7.292%)，均為倍半萜類化合物。

高等植物萜類化合物的前體物質(zhì)異戊烯基焦磷酸(IPP)可通過發(fā)生在細胞質(zhì)中的甲羥戊酸(MVA)途徑和發(fā)生在質(zhì)體中的2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)途徑合成，IPP及其異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)經(jīng)過下游多種酶的催化發(fā)生結(jié)合、縮合、修飾等方式生成結(jié)構(gòu)多樣的萜類化合物[8-9]。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-Hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMGR)是MVA途徑中的第一個限速酶，目前，小麥[10]、甘草[11]、擬南芥[12]、杜仲[13]、蘋果[14]、人參[15]等多個植物的HMGR基因已經(jīng)被克隆。本研究針對菊葉香藜萜類化合物合成中的關(guān)鍵酶HMGR進行深入剖析，利用生物信息學(xué)的方法對菊葉香藜HMGR基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、親疏水性、二級結(jié)構(gòu)、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)、亞細胞定位、功能結(jié)構(gòu)域、三級空間結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進化等多個方面進行預(yù)測與分析，旨在為菊葉香藜精油生物合成的分子機制研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

菊葉香藜HMGR基因序列來源于菊葉香藜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中經(jīng)過比對和功能注釋得到的候選基因序列(本實驗室前期研究)，命名為DsHMGR，已上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(序列號：MG582592)；試驗中所涉及到的其他氨基酸序列均來源于NCBI(National center for biotechnology information)中已登錄的數(shù)據(jù)序列，相關(guān)信息如表1所示。

表1 物種信息匯總

1.2 分析方法

運用GenBank的在線軟件ORF Finder和本地軟件Jellyfish 2.0查找開放閱讀框(ORF)；利用在線軟件ProtParam分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；運用在線分析軟件ProtScale分析蛋白質(zhì)親/疏水性；運用在線SOPMA軟件分析和預(yù)測蛋白質(zhì)氨基酸序列二級結(jié)構(gòu)；運用在線工具SignalP 4.1分析蛋白質(zhì)信號肽；利用在線程序TMHMM進行蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測；運用在線軟件Cell-PLoc 2.0分析蛋白質(zhì)亞細胞定位；采用在線工具CDD(Conserved domain datebase)預(yù)測蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域；蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)以人類HMGR蛋白(PDB ID:3CD0)為模板，利用Phyre2進行三維結(jié)構(gòu)同源建模；利用本地軟件Clustalx進行多條氨基酸序列比對；利用本地軟件MEGA 5.0構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)進化樹，相關(guān)在線生物信息學(xué)分析軟件如表2所示[16]。

表2 生物信息學(xué)在線分析軟件匯總

2 結(jié)果與分析

2.1 菊葉香藜DsHMGR基因序列分析

DsHMGR基因序列全長1 986 bp，GC含量為0.504，ORF Finder預(yù)測結(jié)果表明，DsHMGR包含一段157 bp的5′端非翻譯區(qū)、一段104 bp的3′端非翻譯區(qū)以及一段1 725 bp的開放閱讀框，開放閱讀框為158—1882位，編碼574個氨基酸(圖1)，與已報道的植物HMGR基因堿基數(shù)和編碼氨基酸殘基數(shù)基本一致。

圖1 菊葉香藜DsHMGR基因及所編碼蛋白質(zhì)序列

2.2 菊葉香藜DsHMGR蛋白理化性質(zhì)分析

利用在線軟件ProtParam對DsHMGR蛋白和3種已公布的藜科植物HMGR蛋白進行分析，并比較它們的理化性質(zhì)和氨基酸組成(表3)。4種HMGR蛋白的氨基酸長度為574～581 aa，分子質(zhì)量61.68～62.51 ku，等電點(pI值)6.30～7.89，不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，各類氨基酸的組成基本一致，無明顯差別，非極性氨基酸為主要氨基酸，比例為44.6%～45.9%。其中DsHMGR分子質(zhì)量61.77 ku，pI值為7.46，不穩(wěn)定系數(shù)為49.25，大于40，為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。此外，DsHMGR蛋白中非極性氨基酸所占比例最大，其比例達到了45.8%；極性中性氨基酸的比例也較高，為32.4%；酸性氨基酸與堿性氨基酸的比例相當，分別為10.3%和11.5%。DsHMGR蛋白中含量最多的氨基酸依次為亮氨酸(Leu，9.9%)、絲氨酸(Ser，9.6%)、丙氨酸(Ala，9.1%)和纈氨酸(Val，8.5%)，含量最低的為色氨酸(Trp，0.3%)。

表3 藜科植物HMGR蛋白的理化性質(zhì)及氨基酸組成

2.3 菊葉香藜DsHMGR蛋白親/疏水性分析

蛋白質(zhì)的疏水氨基酸殘基由于水的作用會相互靠近，形成一個疏水內(nèi)核和親水表面。蛋白質(zhì)的疏水作用是蛋白質(zhì)折疊的主要驅(qū)動力，發(fā)揮著維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的重要作用。利用在線軟件ProtScale對DsHMGR蛋白進行親/疏水性預(yù)測。正值表示疏水，其絕對值越大表示越疏水；負值表示親水，其絕對值越大表示越親水；介于-0.5～+0.5主要表示為兩性氨基酸。DsHMGR蛋白預(yù)測結(jié)果如圖2所示，在N端具有2個明顯的疏水峰，分別位于40—58位和73—103位區(qū)域，提示在這2個位置可能有跨膜結(jié)構(gòu)。在DsHMGR蛋白多肽鏈的第51位處有最高分值 3.122，其疏水性水性較強；第6位有最小分值-2.844，其親水性較強。

圖2 DsHMGR蛋白的親/疏水性分析

2.4 菊葉香藜DsHMGR蛋白信號肽分析

信號肽是一段含有15～30個氨基酸殘基的短肽，位于分泌蛋白的N端，主要包括3個區(qū)域：帶正電的N末端區(qū)域、疏水的主要功能區(qū)域以及較長的帶負電的C末端區(qū)域。在分泌蛋白合成結(jié)束后，其N端的信號肽將被切除。利用在線軟件SignalP 4.1對DsHMGR蛋白的信號肽及其位置進行分析，結(jié)果見圖3。典型的信號肽具有較高的S值,在剪切點位點處有最大的C值，Y值有最高峰。由圖3知，DsHMGR蛋白的S值較小，C值未出現(xiàn)一個明顯的最大值，Y值也未發(fā)現(xiàn)有最高峰，均不具有信號肽的特點，由此可推斷DsHMGR蛋白不含有信號肽，為非分泌性蛋白。

圖3 DsHMGR蛋白的信號肽分析

2.5 菊葉香藜DsHMGR蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域與亞細胞定位分析

在蛋白質(zhì)中，20個左右的氨基酸殘基所形成的α螺旋，與生物膜的脂質(zhì)雙分子層相互作用，將蛋白質(zhì)錨定在生物膜中，這樣的結(jié)構(gòu)即跨膜結(jié)構(gòu)域。利用在線軟件TMHMM分析DsHMGR蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，如圖4示，在N端存在2個概率約為1的最大峰，即2個跨膜結(jié)構(gòu)域，分別位于氨基酸序列的37—59位和80—102位區(qū)域。同時運用在線軟件Cell-PLoc 2.0對DsHMGR蛋白進行蛋白質(zhì)亞細胞定位預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DsHMGR蛋白定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。此外，在DsHMGR蛋白的氨基酸序列的C端發(fā)現(xiàn)有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白的定位信號序列KKVL基序(412—415位)，進一步確證DsHMGR蛋白是定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的。因此推斷菊葉香藜的DsHMGR蛋白是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的跨膜蛋白，通過N端的2個跨膜結(jié)構(gòu)將HMGR錨定到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，C端則延伸至細胞質(zhì)中。

圖4 DsHMGR蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)分析

2.6 菊葉香藜DsHMGR蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是由肽鏈主鏈骨架原子所構(gòu)成的局部空間結(jié)構(gòu)，不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲，空間上相鄰的二級結(jié)構(gòu)可協(xié)同完成特定的功能。利用SOPMA在線軟件對DsHMGR蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果如圖5所示，在DsHMGR蛋白的整個肽鏈中均分布有α-螺旋，是DsHMGR蛋白主要的二級結(jié)構(gòu)，散布于整個肽鏈中，所占比例41.64%；其次為無規(guī)則卷曲，所占比例35.89%；延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角分別為15.85%和6.62%。

h代表α-螺旋； e代表延伸鏈； t代表β-轉(zhuǎn)角； c代表無規(guī)則卷曲圖5 DsHMGR蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析

2.7 菊葉香藜DsHMGR蛋白的保守結(jié)構(gòu)域與空間結(jié)構(gòu)分析

利用NCBI的CDD查找DsHMGR蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示，DsHMGR蛋白歸屬于HMGR家族，存在HMGR蛋白特征保守活性位點：具有催化功能的4個氨基酸殘基Glu(253)、Lys(385)、Asp(461)、His(559)；2個HMG-CoA結(jié)合位點EMPVGFIQIP(221—231位)和TTEGCLVA(251—258位)；2個NAD(P)H結(jié)合位點DAMGMNM(347—353位)和GTVGGGT(496—502位)。在DsHMGR蛋白與其他物種HMGR蛋白的氨基酸序列比對(圖6)中，DsHMGR蛋白與其他植物HMGR蛋白在C端和中間區(qū)域氨基酸序列保守性較高，HMG-CoA結(jié)合位點和NAD(P)H結(jié)合位點作為植物HMGR重要的功能結(jié)構(gòu)域保守性也較高；而在HMGR蛋白的N端，除跨膜區(qū)域的保守性相對較高，其余區(qū)域的氨基酸序列則在數(shù)量和種類上均存在較大差異，預(yù)示著DsHMGR蛋白與其他物種HMGR蛋白具有相同的催化功能，但細胞定位與調(diào)控可能不同。

蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)功能，因此對其進行深入研究具有重要指導(dǎo)意義。利用線串法，將DsHMGR基因所編碼的氨基酸序列提交在線三級結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件Phyre2，結(jié)果顯示，DsHMGR蛋白與人類HMGR蛋白(PDB ID:3CD0)具有56%的序列相似性，以該人類HMGR蛋白為模板，通過同源建模構(gòu)建DsHMGR蛋白的三級結(jié)構(gòu)，其結(jié)果如圖7所示。與大多數(shù)植物的HMGR蛋白三級結(jié)構(gòu)類似，DsHMGR蛋白具有3個功能結(jié)構(gòu)域：N-結(jié)構(gòu)域、L-結(jié)構(gòu)域和S-結(jié)構(gòu)域，跨膜區(qū)位于N-結(jié)構(gòu)域內(nèi)，HMG-CoA結(jié)合位點位于L-結(jié)構(gòu)域內(nèi)，NAD(P)H結(jié)合位點位于S-結(jié)構(gòu)域內(nèi)。HMG-CoA、NAD(P)H與DsHMGR蛋白結(jié)合后，Glu(253)、Lys(385)、Asp(461)、His(559)4個氨基酸殘基發(fā)揮催化功能，首先由NAD(P)H和質(zhì)子化的Lys(385)提供兩分子H生成3-羥基-3-甲基-5-羧基戊醛輔酶A基單硫縮醛(Mevaldyl-CoA)和NAD(P)+，然后Mevaldyl-CoA脫去一分子HSCoA生成3-羥基-3-甲基-5-醛基戊酸(Mevaldehyde)，最后NAD(P)H和質(zhì)子化的His(559)為Mevaldehyde提供兩分子H生成甲羥戊酸(Mevalonate)和NAD(P)+(圖8)。

圖6 HMGR蛋白多序列比對分析

2.8 菊葉香藜DsHMGR蛋白進化分析

選取14條來自GenBank數(shù)據(jù)庫的HMGR蛋白序列，其物種信息詳見表1，利用本地軟件MEGA 5.0對DsHMGR蛋白和這14條HMGR蛋白的氨基酸序列進行系統(tǒng)進化分析，采用Neighbor-joining法構(gòu)建HMGR分子系統(tǒng)進化樹，進行聚類關(guān)系分析，其結(jié)果如圖9所示。整個進化樹聚為兩大支，真菌靈芝單獨聚為一支，植物聚為一支。在植物分支中，單子葉植物和雙子葉植物又各自聚為一支，雙子葉植物中大戟科、五加科、葫蘆科、菊科、藜科各自聚為一支，具有明顯的種族特異性。菊葉香藜與藜科植物位于同一分支中，說明菊葉香藜與藜科植物的親緣關(guān)系最近。

圖7 DsHMGR蛋白三級結(jié)構(gòu)模型預(yù)測

圖8 DsHMGR蛋白的催化機制

圖9 HMGR蛋白系統(tǒng)進化樹

3 結(jié)論與討論

植物的次生代謝產(chǎn)物在其生命活動和環(huán)境適應(yīng)等諸多方面發(fā)揮著重要作用，除此以外，在植物次生代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了多種具有藥用價值的化合物，如紫杉醇、青蒿素等。目前，探索植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成機制以及挖掘、分析相關(guān)的酶基因已成為植物次生代謝產(chǎn)物研究的重要內(nèi)容[15]。菊葉香藜精油表現(xiàn)出顯著的抑菌活性和殺蟲活性，其主要成分為萜類化合物。目前對菊葉香藜的研究僅限于其提取方法的優(yōu)化和藥理活性，其分子生物學(xué)方面的研究還很缺乏，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中挖掘、發(fā)現(xiàn)藥用植物次生代謝產(chǎn)物生物合成關(guān)鍵酶基因是闡明次生代謝途徑及調(diào)控機制的重要途徑[17]。

MVA途徑是植物合成萜類化合物前體的兩大途徑之一，該途徑的第1個關(guān)鍵限速酶是HMGR，植物單萜、倍半萜、二萜、三萜類等活性成分的生物合成均需該酶的參與，通過調(diào)節(jié)該酶的表達可以決定各種萜類終產(chǎn)物的產(chǎn)量和比例，因此HMGR可作為萜類化合物代謝的重要調(diào)控位點，近年來，HMGR的結(jié)構(gòu)及催化機制備受關(guān)注[16]。由此本研究對菊葉香藜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進行挖掘，研究結(jié)論如下：(1)獲得了1條HMGR基因全長序列，編碼574個氨基酸，與已報道的植物HMGR氨基酸殘基數(shù)相差不大，非極性氨基酸為主要氨基酸，亮氨酸(Leu，9.9%)為含量最多的氨基酸。(2)對菊葉香藜DsH-MGR蛋白進行理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明，DsHMGR蛋白不含信號肽，為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，在N端具有 2個疏水區(qū)域，含2個跨膜結(jié)構(gòu)域，亞細胞定位預(yù)測與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白的定位信號均顯示DsHMGR蛋白定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，與大多數(shù)植物一致[18-19]。(3)DsHMGR蛋白主要的二級結(jié)構(gòu)為α-螺旋，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲穿插其中，在空間結(jié)構(gòu)上則折疊為“V”形，具有N、L和S 3個催化活性中心結(jié)構(gòu)域，具有4個催化氨基酸殘基(253Glu、385Lys、461Asp、559His)，以及2個HMG-CoA結(jié)合位點(EMPVGFIQIP和TTEGCLVA)和2個NADP(H)結(jié)合位點(DAMGMNM和GTVGGGT)，與其他植物具有相同的催化活性[20-22]。(4)DsHMGR蛋白與其他植物HMGR蛋白氨基酸序列比對也顯示，HMGR蛋白在C端和連接區(qū)具有較高保守性，在N端的序列保守性較低。(5)系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示，菊葉香藜與藜科植物聚為一支，表明其親緣關(guān)系較近。菊葉香藜萜類化合物合成關(guān)鍵酶HMGR的生物信息學(xué)分析，為今后研究菊葉香藜HMGR蛋白的功能、構(gòu)建表達載體、萜類化合物的生物合成分子機制研究與開發(fā)應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。