崔俊霞，魏康寧，謝伊源，王 麗，李用芳

(河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453007)

MicroRNA(miRNA)是一類真核生物體內(nèi)普遍存在的具有重要調(diào)控功能的內(nèi)源非編碼小分子RNA (sRNA)，長度在20～24 nt[1]。植物miRNA與植物的生長、發(fā)育、代謝以及脅迫存在著密切的聯(lián)系[2]，預(yù)測并驗證miRNA調(diào)控的靶基因是闡明miRNA在生物體內(nèi)功能的前提。植物miRNA主要通過剪切機(jī)制導(dǎo)致靶基因被降解，也可通過抑制翻譯對靶基因進(jìn)行調(diào)控，個別miRNA還可以通過誘導(dǎo)靶基因DNA甲基化來調(diào)控靶基因的表達(dá)[3]。在這3種機(jī)制中，miRNA介導(dǎo)的靶基因被剪切和翻譯被抑制方面的研究較為深入，因此，可以根據(jù)miRNA對靶基因的作用方式對靶基因進(jìn)行試驗驗證。簡要介紹了植物miRNA產(chǎn)生過程的最新研究進(jìn)展以及靶基因的預(yù)測方法，重點綜述了植物miRNA靶基因的驗證方法，旨在更深入地研究植物miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，并為利用miRNA改良植物品種提供理論指導(dǎo)。

1 植物miRNA的產(chǎn)生

植物MIRNA(miRNA基因)首先在細(xì)胞核內(nèi)由Ⅱ型RNA聚合酶(Pol Ⅱ)轉(zhuǎn)錄出能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的初級轉(zhuǎn)錄物pri-miRNA[4-5]，再在以DCL1 (Dicer-like 1)、HYL1(Hyponastic leaves 1)和SE (Serrate)為核心組分的切割復(fù)合體的作用下經(jīng)第一次剪切形成pre-miRNA，經(jīng)第二次剪切形成miRNA∶miRNA*復(fù)合體[6-8]。該復(fù)合體在甲基轉(zhuǎn)移酶HEN1 (Hua enhancer 1)作用下3′端被甲基化[9]，然后在HASTY蛋白的作用下被釋放到細(xì)胞質(zhì)中[10-11]。復(fù)合體miRNA∶miRNA*轉(zhuǎn)運到細(xì)胞質(zhì)后，成熟的miRNA與AGO1 (Argonaute 1)蛋白結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex,RISC)，miRNA通過堿基互補(bǔ)配對方式引導(dǎo)RISC識別靶基因并對靶基因進(jìn)行調(diào)控，而miRNA*則被降解[12-14](圖1)。然而近年研究發(fā)現(xiàn)，有些miRNA*的豐度比miRNA還高，甚至可調(diào)控靶基因并導(dǎo)致靶基因被剪切，表明miRNA*不僅僅是miRNA的伴隨鏈，可能還有其他生物學(xué)功能[15-19]。

圖1 植物miRNA的轉(zhuǎn)錄、成熟及對靶基因的調(diào)控作用

植物miRNA基因是一種非編碼基因，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA基因同編碼基因一樣也受到多種因子的調(diào)控。有些因子參與pri-miRNA的轉(zhuǎn)錄過程，如轉(zhuǎn)錄因子共激活因子Mediator 有助于Pol Ⅱ結(jié)合到MIRNA的啟動子區(qū)域[20]，轉(zhuǎn)錄因子NOT2(Negative on TATA less 2)、CCD5(Cell division cycle 5)及延伸復(fù)合體(Elongation complex)與Pol Ⅱ相互作用，可促進(jìn)MIRNA的轉(zhuǎn)錄[21-23]，此外，激酶CDKF;1(Cyclin-dependent kinase F;1)和CDKD (Cyclin-dependent kinase D)可通過磷酸化影響Pol Ⅱ的活性[24](圖1)。另外一些因子參與miRNA的成熟過程，HYL1 有助于DCL1的精準(zhǔn)剪切，最近研究表明,其活性和穩(wěn)定性受磷酸化影響，CPL(C-terminal domain phosphatase-like)和PP4 (Protein phosphatase 4)通過對HYL1脫磷酸化穩(wěn)定HYL1，從而促進(jìn)miRNA的產(chǎn)生[25-26]，RCF3 (Regulator of CBF gene expression 3) 可促進(jìn)CPL對HYL1的脫磷酸化作用[27]。而激酶MPK3(Mitogen-activated protein kinase 3)和SnRK2 (SNF1-related protein kinase subfamily 2) 對HYL1的作用與CPL和PP4正好相反[28-29]。COP1 (Constitutive photomorphogenic 1) 受光信號影響在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的移動也會影響HYL1的穩(wěn)定性和生物活性[30](圖1)。

此外，還有多種影響mRNA轉(zhuǎn)錄、拼接和成熟的蛋白質(zhì)對miRNA的產(chǎn)生也有調(diào)控作用。Yu 等[31]根據(jù)作用特點將這些蛋白質(zhì)分為2類：一類參與從pri-miRNA到miRNA的加工過程，如帽子結(jié)合蛋白CBP80、CBP20[22]，STA1 (Stabilized 1)[32],SICKLE[33]，RNA結(jié)合蛋白TOUGH和AtGRP7 (Glycine-rich RNA-binding protein 7)[34-35],PINP1 (PSR1-interacting protein 1)[36],MOS2 (Modifier of SNC1,2)[37]，這些蛋白質(zhì)基因突變導(dǎo)致體內(nèi)miRNA豐度比野生型低，但miRNA前體累積；而另一類蛋白質(zhì)基因的突變不僅導(dǎo)致miRNA的量減少，而且pri-miRNA的豐度也降低,PRL1(Protein pleiotropic regulatory locus 1) 和DDL (DAWDLE)[21-23]則屬于這一類，這些基因不僅影響MIRNA的轉(zhuǎn)錄，也可能參與pri-miRNA的后續(xù)加工。

2 植物miRNA靶基因的預(yù)測

通常情況下植物miRNA與靶位點序列有著完美或近乎完美的互補(bǔ)配對，因此可以采用生物信息學(xué)方法預(yù)測靶基因[38]。預(yù)測的標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)兩者的互補(bǔ)程度，通過罰分機(jī)制進(jìn)行預(yù)測。在miRNA-靶位點之間1個錯配堿基對罰分為1，G∶U搖擺配對罰分為0.5。在miRNA的2～12 nt的核心區(qū)域不允許超過1個錯配堿基對，在10位和11位不允許有錯配或G∶U配對，當(dāng)miRNA與靶位點的罰分≤4時，認(rèn)為該mRNA是miRNA的潛在靶位點[39-40]。miRU是第1個預(yù)測植物miRNA靶基因的軟件[41]，該軟件后來升級為psRNATarget[42]。多種軟件如Psrobot[40]、Targetfinder[43]、Target-align[44]、 p-TAREF[39]等陸續(xù)被研發(fā)用于植物miRNA靶基因的預(yù)測。此外，植物miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫PMTED (Plant miRNA target expression database)不僅可用于檢索和分析miRNA靶基因的表達(dá)情況，還可用于預(yù)測新miRNA的靶基因并了解靶基因的表達(dá)信息[45]。這些軟件為系統(tǒng)研究miRNA分子的功能提供了極大的便利，但是生物信息學(xué)預(yù)測的靶基因中存在大量的假陽性[46]。而有些真正的靶基因錯配罰分高達(dá)5.5，甚至有些在miRNA的10位和11位之間存在錯配或G∶U配對[47]，因此預(yù)測植物miRNA靶基因的標(biāo)準(zhǔn)直接影響到預(yù)測結(jié)果的可信度。若采用罰分≤4，將丟失一些真正的靶基因，但若采用罰分<6，預(yù)測的靶基因中相當(dāng)一部分并不是真正的靶基因，所以理論上預(yù)測的靶基因尚有待于進(jìn)一步的試驗驗證。

3 植物miRNA靶基因的驗證

植物miRNA靶基因的驗證可以從miRNA對靶基因的作用方式入手。由miRNA介導(dǎo)的靶基因被剪切，可以用RLM-5′RACE(RNA ligase-mediated 5′rapid amplification of cDNA ends)[44]和降解組測序(Degradome sequencing)進(jìn)行驗證[48-50]。而miRNA介導(dǎo)的翻譯被抑制則主要采用報告基因系統(tǒng)進(jìn)行驗證，根據(jù)驗證靶基因的試驗體系，又可分為瞬時共表達(dá)[47-51]和轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)[52]。

3.1 利用RLM-5′RACE 驗證miRNA靶基因

miRNA介導(dǎo)的靶基因mRNA被降解時會產(chǎn)生2個片段(5′剪切片段和3′剪切片段)，其中3′剪切片段比較穩(wěn)定，有一個暴露的5′單磷酸基團(tuán)和polyA尾巴。RLM-5′RACE和降解組測序均利用這2個特點對靶基因進(jìn)行驗證，并可對靶基因的剪切位點進(jìn)行精準(zhǔn)定位。

RLM-5′RACE的原理是用RNA連接酶在3′剪切片段的5′磷酸基團(tuán)處連接一個RNA接頭，然后用 Oligo(dT) 或基因特異性引物(GSP)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再用與RNA接頭對應(yīng)的上游引物和基因特異性下游引物擴(kuò)增mRNA斷口附近的核苷酸序列，進(jìn)一步通過克隆和測序分析來判斷斷口是否是miRNA的剪切位點，從而確定是否是miRNA的靶基因[48,53]。該方法具有相對簡單、方便快捷等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于植物miRNA靶基因的驗證。但由于其驗證結(jié)果單一，每個試驗只能驗證1個靶基因，如果要同時對多個或大量靶基因進(jìn)行分析驗證時，則存在工作量大、費時費力的缺點，隨后發(fā)展起來的降解組文庫測序分析則克服了這一弊端。

3.2 通過降解組測序驗證miRNA靶基因

降解組測序技術(shù)結(jié)合了RLM-5′RACE、高通量測序和生物信息學(xué)分析的優(yōu)勢，可以對細(xì)胞或組織中miRNA介導(dǎo)的mRNA 的3′剪切片段進(jìn)行深度分析[49-50]。Zhai等[54]對該技術(shù)進(jìn)一步改進(jìn)，將index序列引入不同文庫中，因此可將多個降解組文庫混合后測序。降解組測序技術(shù)包括文庫構(gòu)建、高通量測序和生物信息學(xué)分析。與RLM-5′RACE一樣，首先連接一個RNA接頭，該RNA接頭的特點是3′端有IIS型限制性內(nèi)切酶MmeⅠ的識別位點，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA和PCR簡單擴(kuò)增，然后用MmeⅠ對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，再將此片段與3′雙鏈DNA 接頭連接并進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，經(jīng)純化即得到降解組文庫(圖2)。再經(jīng)高通量測序即可得到整個轉(zhuǎn)錄組水平miRNA剪切位點下游20～21個核苷酸序列[49-50]。

圖2 降解組文庫的構(gòu)建

高通量測序產(chǎn)生的海量降解組序列需要結(jié)合生物信息學(xué)分析才能確定miRNA的靶標(biāo)mRNA。目前常用的分析降解組文庫的生物信息學(xué)軟件有CleaveLand和SeqTar (SEQuencing-based sRNA TARget prediction)，兩者均是將降解組文庫序列與待測物種的基因組序列或mRNA 數(shù)據(jù)庫比對，舍棄不能匹配的序列，保留匹配的序列。其目的是將降解組序列匹配到待測物種的mRNA上，從而得到被剪切的mRNA的完整序列，由剪切位點向mRNA的5′端延伸即可得到完整的sRNA候選互補(bǔ)序列，再將此序列與測序物種的miRNA數(shù)據(jù)庫比對，根據(jù)miRNA與靶位點的互補(bǔ)程度和第10位附近剪切信號強(qiáng)度確定潛在的miRNA靶基因[55-56]。CleaveLand嚴(yán)格限制了miRNA與靶位點間的堿基錯配數(shù)目，不允許miRNA在10～11位與其靶基因存在錯配或者G∶U搖擺配對；而SeqTar放寬了miRNA與靶位點互補(bǔ)配對出現(xiàn)錯配的限定條件，允許miRNA的第10～11位存在錯配或G∶U搖擺配對，并允許 miRNA有效剪切位點可對應(yīng)于miRNA第9、10位及11位[56]，這意味著CleaveLand會忽略一些真正的靶基因，而SeqTar通過放寬的標(biāo)準(zhǔn)可找到比CleaveLand更多的miRNA靶基因。

降解組測序是近年來研究植物miRNA靶基因的主要技術(shù)，具有高通量、高效率、低成本的特點，利用該技術(shù)已成功分析驗證了擬南芥[49]、大豆[50]、水稻[47]、玉米[57]等20多種植物miRNA的靶基因[58-60]。

3.3 利用瞬時共表達(dá)系統(tǒng)檢驗miRNA靶基因

瞬時表達(dá)是一種高效的活體驗證體系。應(yīng)用瞬時共表達(dá)(Transient co-expression)驗證miRNA與目的基因相互關(guān)系的原理是miRNA對靶基因的負(fù)調(diào)控作用，如果目的基因是miRNA的靶基因，則其表達(dá)蛋白質(zhì)的量將受到過量表達(dá)的miRNA的限制，反之則不受影響。試驗過程包括將miRNA前體和目的基因分別插入超表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，用注射或浸染方法使農(nóng)桿菌感染煙草葉片下表皮細(xì)胞，之后即可檢測外源基因的表達(dá)或蛋白質(zhì)水平[47,51,56]。浸染時不僅有miRNA前體和目的基因共同浸染，同時有miRNA前體、目的基因和空載體單獨浸染作為對照，可用Northern blot或RT-qPCR來檢測目的基因mRNA表達(dá)水平的變化[47,56]。植物miRNA主要介導(dǎo)靶基因被降解，但是也存在翻譯被抑制的現(xiàn)象，有些miRNA對翻譯的抑制強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于miRNA介導(dǎo)的靶基因降解[11,61]，對于此類miRNA的靶基因可應(yīng)用Western blot 技術(shù)進(jìn)行驗證，然而由于特異性抗體的限制，miRNA介導(dǎo)的靶基因翻譯抑制主要是通過報告基因系統(tǒng)來驗證。

雙熒光素酶(Dual-luciferase)報告基因早已被廣泛用于驗證動物miRNA對靶基因的翻譯抑制[62]。報告基因載體中含有2種能同時表達(dá)的熒光素酶基因,包括螢火蟲螢光素酶基因(Fireflyluciferase，F(xiàn)-luc)和海腎螢光素酶基因(Renillaluciferase，R-luc)，F(xiàn)-luc為主要報告基因，R-luc為內(nèi)參報告基因。若目的基因片段被過量表達(dá)的miRNA抑制，則F-luc的翻譯受阻，而R-luc的翻譯不受影響，此時F-luc/R-luc活性比值下降，從而可以確定miRNA對目的基因具有直接調(diào)控作用。Liu等[51,57]根據(jù)植物miRNA與靶基因相互作用的特點構(gòu)建了2個雙熒光素酶表達(dá)載體系統(tǒng)，一個是將miRNA 靶位點序列插入F-luc的編碼區(qū)，另一個是將miRNA 靶位點序列插入F-luc的3′UTR區(qū)(www.addgene.org,載體編號為55206、55207)。試驗方法與前述的瞬時共表達(dá)一樣，在煙草葉片細(xì)胞中進(jìn)行，但是在構(gòu)建表達(dá)載體時僅僅是將靶位點序列而非靶基因的序列克隆到表達(dá)載體中[51,57]。該技術(shù)的優(yōu)勢在于miRNA與靶基因的相互作用不僅可以在蛋白質(zhì)水平(F-luc/R-luc活性)檢測，而且還可以在mRNA水平(RT-qPCR)進(jìn)行定量。此外,該方法是通過檢測2種熒光素酶報告基因的蛋白質(zhì)或mRNA水平來評判，因此該檢測方法對所有的miRNA與靶位點都適用。

由于瞬時共表達(dá)不需要將外源基因整合到宿主染色體上，所以不受基因的位置效應(yīng)和基因沉默的影響，因此具有操作簡單、周期短、見效快和表達(dá)效率高的優(yōu)勢，且瞬時共表達(dá)不會產(chǎn)生可遺傳的子代，生物安全性高，所以在分子生物學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用。但這種方法與RLM 5′ RACE一樣每次只能驗證miRNA的單一靶基因，不適用于大量靶基因的驗證，此外該技術(shù)根據(jù)miRNA與靶基因的負(fù)相關(guān)性判斷目的基因是否是miRNA的靶基因，無法對miRNA的靶位點進(jìn)行準(zhǔn)確定位。

3.4 利用轉(zhuǎn)基因植物驗證miRNA的功能

Sunkar等[52]確認(rèn)了miR398的靶基因Cu/Zn超氧化物歧化酶基因CSD1和CSD2，首次揭示了miRNA與脅迫的關(guān)系。通過對擬南芥轉(zhuǎn)基因過量表達(dá)突變的miR398或?qū)iR398具有抗性的CSD2，驗證了miR398對CSD的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。賈小云等[63]以轉(zhuǎn)基因番茄和野生番茄為材料，揭示了miR828與其靶基因SlMyb7-like的相關(guān)性。Chuck等[64]在柳枝稷中過量表達(dá)玉米miR156基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柳枝稷營養(yǎng)生長階段延長且不開花，驗證了其靶基因SPL調(diào)控生長發(fā)育進(jìn)程。然而由于轉(zhuǎn)基因需要周期長，該技術(shù)較少用于驗證miRNA靶基因，其主要用途是靶基因的功能驗證。

4 問題及展望

迄今為止，有關(guān)植物miRNA分析研究的報道很多，針對miRNA靶基因的預(yù)測及分析工具也不斷涌現(xiàn)，這在一定程度上可以幫助人們挖掘miRNA的靶基因，但是如何提高預(yù)測靶基因的準(zhǔn)確性是各種預(yù)測工具面臨的共同問題。由于靶基因的試驗驗證技術(shù)要求高、費時費力、花費大，通過試驗驗證的miRNA靶基因大多屬于保守型miRNA的靶基因，而驗證的非保守型miRNA靶基因的數(shù)目非常有限，靶基因的驗證已成為研究和應(yīng)用miRNA的瓶頸。雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)能有效檢測miRNA是否在翻譯水平對靶基因有抑制作用，但是目前尚缺乏有效的從整體水平研究植物miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制的技術(shù)。降解組測序能有效地分析整個轉(zhuǎn)錄組水平miRNA介導(dǎo)的靶基因降解，但由于降解組測序只能得到20～21個有效堿基序列，有些片段能同時定位到多個位點，這些無法準(zhǔn)確定位的潛在靶基因以及降解組分析預(yù)測的新靶基因還有待于采用RLM 5′RACE或瞬時共表達(dá)技術(shù)進(jìn)一步驗證，因此多種手段的綜合利用是驗證植物miRNA靶基因的趨勢。此外，已驗證的靶基因多是大量表達(dá)的保守型miRNA的靶基因，如何發(fā)現(xiàn)并驗證低豐度miRNA的靶基因則是今后努力的方向。