曹慧娟，徐君輝，鄒俊杰，張賓，孫繼鵬

（1.舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心，浙江舟山 316021）（2.浙江海洋大學(xué)，浙江省海產(chǎn)品健康危害因素關(guān)鍵技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316022）（3.國(guó)家海洋局第三海洋研究所，福建廈門(mén) 361000）

MT廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物體內(nèi)，可被重金屬離子、細(xì)胞毒性藥物、有機(jī)化學(xué)藥物及應(yīng)激刺激等誘導(dǎo)合成。國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上常見(jiàn)MT產(chǎn)品，大部分來(lái)自兔肝臟中提純獲得，但其原料來(lái)源較為特殊，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，提純過(guò)程操作繁雜、產(chǎn)量極低且價(jià)格極其昂貴[3]。與動(dòng)植物源提取相比，通過(guò)微生物源（如酵母、枯草芽孢桿菌等）誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生 MT，具有來(lái)源廣、成本低、發(fā)酵周期短等優(yōu)點(diǎn)[4]。

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）在用于表達(dá)異源蛋白方面具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如酵母細(xì)胞易于分子遺傳學(xué)操作、生長(zhǎng)速度快及生物毒性低，其適于外源基因的高水平誘導(dǎo)表達(dá)，還可進(jìn)行高密度細(xì)胞培養(yǎng)，利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[5]。

關(guān)于微生物源的MT提取及分離純化方法，諸如加熱除雜蛋白、緩沖液勻漿離心法、凝膠過(guò)濾、離子交換及多種層析結(jié)合法等，由于微生物生長(zhǎng)代謝的復(fù)雜性，仍存在如雜蛋白干擾嚴(yán)重、MT提取率不高等問(wèn)題，其分離純化方法仍有待進(jìn)一步提高。課題組前期以巴斯德畢赤酵母為對(duì)象，經(jīng)培育誘導(dǎo)條件優(yōu)化（搖床轉(zhuǎn)速為 220 r/min，甲醇誘導(dǎo)劑 5%，CuCl2誘導(dǎo)劑50 μmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間24 h），培養(yǎng)發(fā)酵液中MT誘導(dǎo)表達(dá)量達(dá)0.29 mg/mL（結(jié)果另文報(bào)道）。本研究以巴斯德畢赤酵母發(fā)酵液為對(duì)象，對(duì)其中MT的提取分離及純化條件進(jìn)行優(yōu)化，并初步評(píng)價(jià)獲得MT的清除自由基活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）表達(dá)菌株（GS-115），由國(guó)家海洋局第三海洋研究所海洋生物資源綜合利用工程技術(shù)研究中心（廈門(mén)）經(jīng)基因重組獲得；考馬斯亮蘭 G-250、茚三酮及苯酚等，西隴化工股份有限公司；牛血清白蛋白（BSA）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）等，北京索萊寶科技有限公司；Tris-(2-carboxylethyl)-phosphine（TCEP）、Ammnium 7-Fluoro-2,1,3-bzoxadiazole- 4-sulfonate（SBD-F）及金屬硫蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（來(lái)自兔肝）等，Sigma-ALDRICH上海貿(mào)易有限公司。以上實(shí)驗(yàn)所用試劑，均為分析純。

Waters 2475熒光檢測(cè)器、Waters e2695高效液相色譜儀，沃特世科技有限公司；UV-1780紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津儀器有限公司；Milli-Q超純水儀，美國(guó)Millipore公司；SCINOTMKT260凱氏定氮儀、SCINOTMDT208高溫消化爐，瑞士 FOSS公司；SRMXM-4平板膜分離設(shè)備，三達(dá)膜科技有限公司；多功能全自動(dòng)層析系統(tǒng)，上海滬西分析儀器廠(chǎng)有限公司。

1.2 酵母發(fā)酵MT的制備

依據(jù)課題組前期研究[3]，將畢赤酵母菌進(jìn)行培育、誘導(dǎo)表達(dá)，制備MT發(fā)酵液工藝：將酵母在培育溫度30 ℃，初始pH 9.0，搖床轉(zhuǎn)速240 r/min和菌種接種量4%條件下，進(jìn)行搖瓶培育20 h；隨后將培育后酵母加入CuCl2進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵，具體在菌體密度 OD6009.7，搖床轉(zhuǎn)速220 r/min，誘導(dǎo)劑甲醇終濃度5%（V/V）和CuCl2終濃度50 μmol/L條件下，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)24 h，獲得含MT的畢赤酵母發(fā)酵液（結(jié)果另文報(bào)道）。

1.3 酵母發(fā)酵液的預(yù)處理

1.3.1 高溫沉降法除雜

其實(shí)，這次真的是易非誤會(huì)了，他們只是想對(duì)易非客氣，想別吵著她了，可這突如其來(lái)的客氣，反倒讓易非覺(jué)得生疏和孤單。

將30 mL發(fā)酵液分別置于50、60、70和80 ℃水浴條件下，恒溫保存0、10、20、30、40、50和60 min，取出后常溫冷卻至室溫，8000 r/min離心 20 min（4 ℃），取上清液測(cè)定MT含量；同時(shí)取沉淀物進(jìn)行稱(chēng)重，考察高溫沉降對(duì)發(fā)酵液中MT穩(wěn)定性及雜質(zhì)去除效果影響。

1.3.2 等電點(diǎn)沉淀法除雜

準(zhǔn)確量取1.0 mL發(fā)酵液分別加入0、2、4、6、8、10、12、14、16、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90和100 μL，4 mol/L HCl溶液，充分混勻后，8000 r/min離心20 min（4 ℃），取上清液測(cè)定總蛋白質(zhì)和MT含量，考察等電點(diǎn)法對(duì)發(fā)酵液中MT耐酸性及雜質(zhì)去除效果影響。蛋白質(zhì)含量測(cè)定，采用考馬斯亮蘭法進(jìn)行。

1.4 酵母發(fā)酵液中MT的膜分離

將經(jīng)預(yù)處理后酵母發(fā)酵液，經(jīng)截留分子量為50 ku硝酸纖維膜超濾膜，以去除發(fā)酵液中其它雜質(zhì)，獲得MT濃縮液經(jīng)冷凍干燥后即為MT粗提物。膜分離參數(shù)：進(jìn)口壓力0.5 MPa，出口壓力0.2 MPa，超濾溫度26 ℃?？疾炷し蛛x對(duì)發(fā)酵液中雜蛋白去除效果及對(duì)MT截留率影響。

1.5 發(fā)酵液中MT的純化

采用凝膠層析法對(duì)MT粗提物進(jìn)一步純化，具體參數(shù)：DEAD-FF瓊脂糖凝膠為層析介質(zhì)，MT粗提物上樣濃度0.6 mg/mL，樣品溶液pH 8.5，上樣流速1.0 BV/h。樣品吸附飽和后，采用 pH 8.5，10 mmol/L Tris-HCl緩沖液洗脫吸附雜蛋白，進(jìn)而通過(guò)pH 8.5，含 0.6 mol/L NaCl的 Tris-HCl緩沖液洗脫目標(biāo)蛋白（MT），層析分離收集MT。進(jìn)一步將收集的MT溶液，調(diào)節(jié)pH至6.0，加入0.1 mol/L EDTA（實(shí)驗(yàn)中，采用CuCl2進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得MT多以MT-Cu2+形式存在，需進(jìn)一步去除Cu2+），混勻反應(yīng)10 min后，經(jīng)SephadexG-25脫鹽，冷凍干燥制備MT純化樣品。

1.6 純化MT活性評(píng)價(jià)

利用H2O2與Fe2+混合體系模擬產(chǎn)生OH·自由基，通過(guò)顯色劑結(jié)晶紫與OH·發(fā)生親電加成反應(yīng)而褪色作考察指標(biāo)，評(píng)價(jià)制備MT對(duì)OH·清除能力[6]。利用鄰苯三酚在堿性條件下發(fā)生自氧化反應(yīng)，產(chǎn)生 O2-·自由基與反應(yīng)物，評(píng)價(jià)制備 MT對(duì) O2-·清除能力[7]。利用DPPH溶于乙醇后顯紫紅色，加入自由基清除劑后，由于孤對(duì)電子被配對(duì)從而發(fā)生褪色現(xiàn)象，從而評(píng)價(jià)制備MT對(duì)DPPH自由基清除能力[8]。

1.7 指標(biāo)測(cè)定

1.7.1 MT含量測(cè)定

取20 μL MT 上清液，加入3 μL 20%（m/V）TCEP溶液、10 μL 1 mg/mL SBD-F 溶液和 75 μL、pH 10.5反應(yīng)緩沖液（含1 mol/L硼酸、30 mmol/L EDTA和0.8 mol/L KOH），混勻后50 ℃水浴反應(yīng)30 min，加入10 μL、4 mol/L HCl終止反應(yīng)。將混合體系采用 20 mmol/L、pH 7.5緩沖液定容至1 mL，混合均勻，經(jīng)0.22 μm水系膜后，進(jìn)行HPLC分析[9]。流動(dòng)相：乙腈∶磷酸緩沖液（25 mmol/L，pH 7.5）∶甲醇體系=18∶80∶2；色譜柱：ODS-BP（Sinochrom，4.6 mm×250 mm，5 μm）C18柱；進(jìn)樣量：40 μL；洗脫時(shí)間：20 min；流速：0.5 mL/min；柱溫：25 ℃；激發(fā)波長(zhǎng)380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)510 nm；標(biāo)準(zhǔn)品：兔肝MT，保留時(shí)間：7.3～7.7 min。

1.7.2 金屬含量測(cè)定

稱(chēng)取待測(cè)樣品0.80～1.20 g，加入12 mL HNO3和3 mL HClO4，混勻后進(jìn)行消解。電熱消解程序：升溫至100 ℃，保持30 min；至130 ℃，保持60 min；再升溫至150 ℃，至消解完成；最后升溫至180 ℃，趕酸至樣品容量約2 mL。冷卻至室溫，超純水定容50 mL，原子吸收分光光度計(jì)法測(cè)定各金屬元素含量[10]。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用origin 8.0、SPSS及Design Expert 8.0進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與討論

2.1 酵母發(fā)酵液的預(yù)處理

2.1.1 高溫沉降法預(yù)處理效果

圖1 加熱溫度對(duì)發(fā)酵液中MT（a）和離心沉淀（b）含量的影響Fig.1 Effect of temperature and holding-time of heating on content of MT (a) and sediment (b) in fermentation broth

由圖1結(jié)果可知，酵母發(fā)酵液經(jīng)50～60 ℃加熱處理60 min，發(fā)酵液中MT損失率都在10%以?xún)?nèi)；30 mL發(fā)酵液經(jīng)加熱離心，獲得沉淀含量范圍為1.00～1.14 g。采用70～80 ℃高溫處理40 min，發(fā)酵液中MT含量下降迅速。80 ℃條件下加熱10 min，發(fā)酵液中MT損失率為4.55%，沉淀固形物含量范圍為1.00～1.19 g；而加熱時(shí)間超過(guò)10 min后，MT損失率迅速升高。研究表明，MT由于分子結(jié)構(gòu)的特殊性，其耐熱性十分突出，因此可利用短時(shí)、高溫處理，去除發(fā)酵液大部分耐熱性較差雜蛋白，同時(shí)也起到滅菌滅酶、減少后期純化過(guò)程中對(duì)目的蛋白降解作用[11]。綜合考慮，選擇80 ℃加熱10 min進(jìn)行發(fā)酵液預(yù)處理，再以8000 r/min離心20 min，獲得較低雜蛋白含量的酵母發(fā)酵液。

2.1.2 等電點(diǎn)沉降法預(yù)處理效果

在不同體積酸處理?xiàng)l件下，發(fā)酵液中MT及總蛋白含量波動(dòng)較大，結(jié)果如圖2所示。隨著加酸量的不斷增加，上清液中總蛋白含量呈先迅速降低后趨于平緩趨勢(shì)，表明發(fā)酵液中大部分蛋白耐酸性差，可通過(guò)加酸后離心而去除。上清液中MT含量總體呈平緩趨勢(shì)，僅在達(dá)到MT等電點(diǎn)時(shí)（加酸量42 μL）含量最低，說(shuō)明MT對(duì)酸穩(wěn)定性較強(qiáng)。在1 mL發(fā)酵液中加入30 μL 4 mol/L HCl時(shí)，總蛋白含量達(dá)到最低，此時(shí)MT損失率為6.47%。因此，在不改變MT穩(wěn)定性條件下，可通過(guò)改變發(fā)酵液的酸度，使發(fā)酵液中雜蛋白在酸性條件下變性或達(dá)到等電點(diǎn)的方法去除部分雜蛋白，達(dá)到發(fā)酵液前處理中除雜的目的[12]。綜合比較以上兩種預(yù)處理方法，保證較低MT損失率、良好滅菌、滅酶及除雜效果，同時(shí)避免加入試劑對(duì)MT造成污染，并考慮到實(shí)際生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性、安全性及簡(jiǎn)易性，本試驗(yàn)采用熱處理法作為發(fā)酵液預(yù)處理方法：80 ℃條件下保溫10 min后，常溫8000 r/min離心20 min，取上清液為預(yù)處理后酵母發(fā)酵液。

圖2 加酸處理對(duì)發(fā)酵液中MT和離心沉淀含量的影響Fig.2 Effects of the acidity on content of MT and sediment in fermentation broth

2.2 酵母發(fā)酵液中MT的膜分離效果

選用50 ku平板超濾膜處理后，獲得發(fā)酵液中MT得率為94.29%，雜蛋白去除率為24.82%。由此，平板超濾可有效去除發(fā)酵液中殘留的一些大分子量雜蛋白，并對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行高效濃縮。經(jīng)HPLC測(cè)定，經(jīng)50 ku平板膜超濾除雜濃縮液中MT濃度達(dá)1.77 mg/mL。

2.3 發(fā)酵液中MT的純化效果

圖3 DEAE-FF柱層析分離結(jié)果Fig.3 Column chromatography results of DEAE-FF

溶液中的帶電溶質(zhì)分子通過(guò)瓊脂糖凝膠時(shí)，其與離子交換劑中帶相同電荷的離子進(jìn)行交換，從而達(dá)到分離目的。在溶液體系pH、上樣濃度及流速、洗脫緩沖液等單因素優(yōu)化基礎(chǔ)上，獲得最佳純化工藝參數(shù)為：上樣濃度0.60 mg/mL、pH 8.5上樣流速1.00 BV/h；10 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.5）洗脫雜蛋白，0.60 mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液（pH 8.5）洗脫MT。經(jīng)平板超濾后的酵母發(fā)酵濃縮液，經(jīng) DEAE-FF層析介質(zhì)吸附及洗脫曲線(xiàn)，如圖3所示。由結(jié)果可知，大部分的雜蛋白先被洗脫，MT活性成分后被洗脫，分離效果較好。

2.4 MT中Cu2+的脫除效果

圖4 不同pH對(duì)MT中結(jié)合的Cu2+金屬脫除率影響Fig.4 Effect of different pH on the removal rate of Cu2+combined by MT

EDTA對(duì)多數(shù)重金屬均具有良好螯合效果，常用作消除微量重金屬導(dǎo)致的酶催化反應(yīng)中的抑制作用。不同pH值的EDTA溶液，對(duì)MT（DEAE-FF柱層析純化后）中結(jié)合的Cu2+脫除效果如圖4所示。在酸性條件下，MT中結(jié)合的Cu2+易發(fā)生解離，部分Cu2+能有效被EDTA鰲合，達(dá)到脫除Cu2+的目的[13]。在pH在1.5～4.0范圍內(nèi)，MT中結(jié)合的Cu2+脫除率隨pH上升而不斷提高，而后逐漸趨于平緩；EDTA溶液在pH=6.0時(shí)，脫除率最高達(dá)到 61.90%。在該條件下，脫除MT中結(jié)合的Cu2+、SephadexG-25脫鹽，冷凍干燥后獲得MT純化樣品。

在MT純化樣品溶液中添加一定量金屬元素，評(píng)價(jià)MT對(duì)金屬元素的再吸附性能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MT對(duì)Pb2+、Cr6+、Cd2+和Cu2+均具有一定再吸附能力，其中對(duì) Cr6+吸附率為 75.70%；其次為 Pb2+，吸附率為62.10%；對(duì)Cd2+的吸附率為22.60%；對(duì)Cu2+的吸附率僅為12.40%，可能是因?yàn)樵蠱T分子中Cu2+的結(jié)合位點(diǎn)已接近飽和。綜上，MT對(duì)金屬元素的再吸附能力依次為 Cr6+＞Pb2+＞ Cd2+＞ Cu2+。

2.5 純化MT對(duì)自由基的清除作用

MT是一種有效的自由基捕獲劑，其在清除自由基同時(shí)會(huì)釋放出微量金屬元素，促使免疫功能和細(xì)胞代謝，從而提高機(jī)體抗炎及自我保護(hù)修復(fù)的能力。MT對(duì)OH·、O2-·和DPPH自由基的清除率，見(jiàn)圖5。

圖5 MT 對(duì) OH·（a）、O·（b）和DPPH（c）自由基的清除率Fig.5 The removal rate of OH· (a), O· (b), and DPPH (c)radicals by MT

由結(jié)果可知，MT對(duì)H2O2-Fe2+體系（0.25 mL、0.20 mmol/L結(jié)晶紫，0.5 mL、1.00 mmol/L FeSO4，0.25 mL、0.02% H2O2混合體系）產(chǎn)生OH·自由基50%清除率量為 0.03 mg；對(duì)鄰苯三酚溶液（7.5 μL、45 mmol/L）產(chǎn)生O·自由基50%清除率量為0.04 mg；對(duì)DPPH（4 mL、50 mg/L）自由基50%清除率量為0.09 mg。研究表明，MT具有較好的清除自由基能力，其主要是MT分子中金屬離子的動(dòng)力學(xué)非指向性和巰基的親和性，使得MT在與親電性物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，尤其是與某些自由基發(fā)生反應(yīng)。MT清除OH·自由基能力是SOD的10000倍，而清除氧自由基的能力約是谷胱甘肽GSH的25倍，在體內(nèi)可以作為補(bǔ)體抗氧化劑[14]。

3 結(jié)論

以CuCl2誘導(dǎo)畢赤酵母發(fā)酵表達(dá) MT，針對(duì)培養(yǎng)發(fā)酵液采用高溫加熱沉淀預(yù)處理法減少其雜蛋白含量，再經(jīng)平板膜超濾濃縮、DEAD-FF瓊脂糖凝膠層析及EDTA螯合脫除Cu2+等純化工藝，分離制備了具有再吸附金屬離子及較好清除自由基活性的MT制品。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了酵母源MT的純化工藝，但制備MT純度仍不太高，后續(xù)將進(jìn)一步對(duì)酵母發(fā)酵MT高純化產(chǎn)品開(kāi)發(fā)深入研究。