何依雪 劉文 沈祥陵

（三峽區(qū)域植物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（三峽大學(xué)）湖北省三峽特色植物繁育工程技術(shù)研究中心 三峽大學(xué)生物技術(shù)研究中心，宜昌 443000）

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）屬于茄科多年生草本植物，塊莖可供食用，是全球第四大重要的糧食作物，僅次于小麥、稻谷和玉米。由于馬鈴薯在生產(chǎn)中長(zhǎng)期采用無(wú)性繁殖，病毒積累危害，造成馬鈴薯產(chǎn)量和質(zhì)量下降。利用植物莖尖分生組織培養(yǎng)技術(shù)獲得馬鈴薯脫毒苗，將脫毒苗進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得的種薯為脫毒試管薯［1］。試管薯因其無(wú)病毒感染，不受季節(jié)影響，易儲(chǔ)存等優(yōu)點(diǎn)已成為繼脫毒試管苗之后保存種質(zhì)和生產(chǎn)無(wú)毒種薯的一種新形式。但是目前脫毒試管薯的應(yīng)用面積比例并不大，主要是存在試管薯誘導(dǎo)效率低，成本較高，結(jié)薯小不能滿足生產(chǎn)需要等問(wèn)題。

馬鈴薯塊莖形成受到諸如光照、溫度、氮素等多種外界因子的影響，其中短日照（Short day，SD）對(duì)誘導(dǎo)馬鈴薯塊莖形成有非常重要的影響［2］，實(shí)驗(yàn)證明SD誘導(dǎo)植株產(chǎn)生的塊莖形成刺激物質(zhì)可通過(guò)嫁接傳遞［3］，所以植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)成為探究馬鈴薯種薯生長(zhǎng)發(fā)育的重要組成部分。胡云海等［4］發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素IAA和NAA能促進(jìn)微型薯個(gè)數(shù)和重量的增加。眾多研究表明赤霉素（Gibberellin，GA）對(duì)馬鈴薯塊莖形成有抑制作用，內(nèi)源GA水平的降低是馬鈴薯匍匐莖膨大的重要因素［5］。由于馬鈴薯組培苗繼代之后容易出現(xiàn)弱化、叢生等現(xiàn)象，多效唑、丁酰肼等植物生長(zhǎng)抑制劑被廣泛用于馬鈴薯組培苗的壯苗。丁酰肼（B9），為低毒性植物生長(zhǎng)抑制劑，化學(xué)式C6H12N2O3，是GA的生化合成抑制劑［6］。實(shí)驗(yàn)表明，B9對(duì)馬鈴薯種薯的生長(zhǎng)發(fā)育有促進(jìn)作用［7］，說(shuō)明GA的抑制劑可以促進(jìn)馬鈴薯種薯形成。但是2017年 ?ev?íková等［8］利用 UHPLC-MS/ MS 分析馬鈴薯自發(fā)結(jié)薯突變體內(nèi)的GAS含量，結(jié)果表明，在突變體結(jié)薯期間GAS的含量遠(yuǎn)高于普通馬鈴薯，并對(duì)GA抑制馬鈴薯塊莖形成的作用提出懷疑。因?yàn)榻M織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明GA會(huì)抑制馬鈴薯試管薯形成，所以并未對(duì)此結(jié)果下定論。但是Yamaguchi［5］、宿飛飛［7］、?ev?íková等［8］的組織培養(yǎng)方法是單獨(dú)施加GA或者B9來(lái)探究激素對(duì)于馬鈴薯的影響，此實(shí)驗(yàn)方法只能單一的探究GA含量增長(zhǎng)或者降低對(duì)馬鈴薯的影響，所以得出的結(jié)論不能準(zhǔn)確反映GA對(duì)于馬鈴薯種薯生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的影響。本研究通過(guò)在培養(yǎng)基中同時(shí)添加不同濃度的GA與B9，并觀察測(cè)量馬鈴薯薯種的變化，來(lái)探究GA和B9對(duì)馬鈴薯生長(zhǎng)發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：馬鈴薯“Desiree”。試劑：MS粉末（Phyto Technology），蔗糖（科密歐），瓊脂（Solarbio），Ca（NO3）2（SIGMA），可溶性淀粉（科密歐），I2（麥克林），IK（國(guó)藥）。

1.2 方法

1.2.1 試管苗的培養(yǎng) 用MS+3%蔗糖+1%瓊脂（MS3）培養(yǎng)馬鈴薯莖段，將脫毒馬鈴薯苗剪段插瓶培養(yǎng)至馬鈴薯苗生長(zhǎng)良好，一株可繼代出5-6株，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。1.2.2 激素的施用 基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，使用不同濃度的GA和不同濃度的B9做成4×4的正交實(shí)驗(yàn)（表1）。將馬鈴薯剪成5 cm長(zhǎng)的莖段，每瓶5個(gè)莖段，1株頂芽，4株側(cè)芽（每株側(cè)芽帶一片葉一個(gè)腋芽點(diǎn)），每種培養(yǎng)基一共栽種40株。

表1 馬鈴薯培養(yǎng)基編號(hào)

每周統(tǒng)計(jì)每株馬鈴薯的株高，側(cè)芽數(shù)，葉片數(shù)（除頂芽部分），第4周以后由于株高生長(zhǎng)到培養(yǎng)瓶頂端，會(huì)影響測(cè)量的準(zhǔn)程度，所以停止對(duì)株高的測(cè)量。第8周開始對(duì)馬鈴薯側(cè)芽，馬鈴薯結(jié)薯數(shù)，薯重進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.3 淀粉含量的測(cè)定 利用徐昌杰等［9］的方法繪制淀粉含量標(biāo)曲，測(cè)定16種培養(yǎng)基中馬鈴薯塊莖的淀粉含量。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 利用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用GraphPad Prism 6作圖。

2 結(jié)果

2.1 GA與B9對(duì)馬鈴薯外形的影響

馬鈴薯植株栽種進(jìn)培養(yǎng)基到長(zhǎng)成植株的8周后，觀察每種培養(yǎng)基中的馬鈴薯植株的外觀，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表 2）。

添加B9的馬鈴薯植株葉片寬大，莖稈粗壯，但是株高較矮，添加GA的馬鈴薯株高較高，側(cè)芽較多，但是葉片細(xì)小，莖稈細(xì)弱，GA與B9同時(shí)添加時(shí)，馬鈴薯葉片寬大，莖稈粗壯，株高正常，側(cè)芽較多但是側(cè)芽粗壯成型（圖1）。

2.2 GA與B9對(duì)馬鈴薯株高的影響

2.2.1 GA與B9對(duì)于馬鈴薯總株高的影響 GA會(huì)促進(jìn)馬鈴薯植株長(zhǎng)高，GA濃度為1.0 mg/L，B9濃度為0 mg/L時(shí)馬鈴薯苗最高。B9對(duì)馬鈴薯株高的影響則正好相反，B9濃度為40 mg/L，GA濃度為0 mg/L最矮。GA與B9對(duì)馬鈴薯的共同作用則顯示（圖2-A），在GA濃度相同時(shí)，B9的濃度越高株高越矮；B9濃度相同時(shí)，GA濃度越高，株高越高。

2.2.2 GA對(duì)馬鈴薯側(cè)芽高度的影響 GA對(duì)馬鈴薯株高有促進(jìn)作用，但是GA對(duì)于頂芽和側(cè)芽的影響卻存在差異，在施加相同濃度的GA時(shí)，馬鈴薯側(cè)芽高度要大于頂芽，施加0.1 mg/L GA+0 mg/L B9的培養(yǎng)基中，側(cè)芽與頂芽的差值最高。在GA濃度相同時(shí)，施加B9的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)會(huì)縮短頂芽高度的差距（圖2-B）。

表2 不同激素濃度對(duì)馬鈴薯外形的影響

圖1 不同培養(yǎng)基對(duì)馬鈴薯外形的影響

2.2.3 GA與B9對(duì)馬鈴薯每段莖節(jié)高度的影響 根據(jù)對(duì)馬鈴薯葉片數(shù)（除頂芽）的統(tǒng)計(jì)，不同培養(yǎng)基之間的葉片數(shù)相差不大（圖2-C），但是由于總株高有差異，所以每一段莖節(jié)的高度［莖節(jié)高度（cm）=株高（cm）/葉片數(shù)（除頂芽）］就有差異，可見(jiàn)隨著GA濃度的增高，每一莖節(jié)的高度逐漸增高。添加B9可以縮短馬鈴薯每段莖節(jié)高度（圖2-D）。

2.3 GA與B9對(duì)馬鈴薯側(cè)芽的影響

當(dāng)B9濃度為0 mg/L時(shí)，各種GA濃度下側(cè)芽數(shù)都高于同組的其他值。其中施加GA濃度為0.5 mg/L時(shí)，側(cè)芽數(shù)最高。施加B9之后側(cè)芽數(shù)就會(huì)顯著降低（圖2-E）。當(dāng)B9濃度為0 mg/L時(shí)，在各種GA濃度下側(cè)芽的發(fā)生率［側(cè)芽發(fā)生率（%）=側(cè)芽數(shù)/葉片數(shù)（除頂芽）×100%］都達(dá)到80%以上，其中當(dāng)施加GA濃度為0.5 mg/L時(shí)，側(cè)芽發(fā)生率達(dá)到91.67%。而對(duì)照組的側(cè)芽發(fā)生率只有56.06%。在同一個(gè)GA濃度下，施加B9會(huì)減少側(cè)芽的發(fā)生率（圖2-F）。

2.4 GA與B9對(duì)馬鈴薯結(jié)薯的影響

馬鈴薯試管苗在生長(zhǎng)后期會(huì)產(chǎn)生種薯，不同部位的種薯形狀與長(zhǎng)勢(shì)不同。根部長(zhǎng)出的種薯數(shù)量多，全部在培養(yǎng)基中發(fā)育，但是顆粒小，無(wú)法長(zhǎng)大，也沒(méi)有芽點(diǎn)；莖部長(zhǎng)出的種薯數(shù)量偏少，部分在培養(yǎng)基中發(fā)育，部分在空氣中發(fā)育，顆粒大，有芽點(diǎn)可以再生成馬鈴薯植株，所以對(duì)莖部長(zhǎng)出的馬鈴薯進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

在第80天統(tǒng)計(jì)馬鈴薯莖部的結(jié)薯情況，隨著B9濃度的增加，馬鈴薯的結(jié)薯率逐漸增加，但是最高不超過(guò)0.5個(gè)/株，單獨(dú)添加GA的培養(yǎng)基中結(jié)薯率都在0.2個(gè)每株上下，但是GA和B9同時(shí)添加時(shí)，馬鈴薯的結(jié)束率增大到0.8個(gè)/株，最高能達(dá)到1.33個(gè)/株。其中，第6，7，10號(hào)培養(yǎng)基的馬鈴薯結(jié)薯率達(dá)到了1.2個(gè)馬鈴薯每株，遠(yuǎn)高于對(duì)照組0.2個(gè)/株（圖3-A）。

圖2 GA與B9對(duì)馬鈴薯株高，側(cè)芽，葉片的影響

將所的的所有馬鈴薯進(jìn)行重量統(tǒng)計(jì)，只添加GA的馬鈴薯塊莖均重在GA濃度為0.5 mg/L時(shí)最大，為180.19 mg；只添加B9的馬鈴薯塊莖均重在濃度為20 mg/L時(shí)最大，為131.75 mg；GA和B9同時(shí)添加時(shí)，培養(yǎng)基中激素組合為0.1 mg/L GA+20 mg/L B9，0.1 mg/L GA+40 mg/L和 0.5 mg/L GA+40 mg/L B9時(shí)，馬鈴薯塊莖均重達(dá)到200 mg以上，其中0.1 mg/L GA+20 mg/L B9的激素濃度組合馬鈴薯均重最大達(dá)到351 mg（圖3-B）。

將馬鈴薯薯重做成箱圖（圖4）顯示，部分?jǐn)?shù)據(jù)離散程度很大，不夠集中，如6號(hào)、7號(hào)培養(yǎng)基所得的馬鈴薯薯重；而5號(hào)、16號(hào)培養(yǎng)基馬鈴薯薯重雖然集中但均重不大。

2.5 GA與B9對(duì)馬鈴薯淀粉含量的影響

用可溶性淀粉制作淀粉含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y = 0.1621x-0.0027，R2=0.99902。通過(guò)對(duì)不同激素組合的培養(yǎng)基中收取的馬鈴薯進(jìn)行淀粉含量的測(cè)量，利用標(biāo)曲和計(jì)算公式計(jì)算出馬鈴薯中的淀粉含量（mg/g）。對(duì)數(shù)據(jù)的單因素方差分析顯示，施加0.5 mg/L GA時(shí)，馬鈴薯淀粉含量最高，但與0 mg/L和0.1 mg/L GA沒(méi)有顯著性差異，但是1.0 mg/L GA會(huì)對(duì)馬鈴薯淀粉含量有抑制作用，且與其他組有顯著性差異。

施加40 mg/L B9會(huì)降低馬鈴薯中的淀粉含量（圖5-A）。對(duì)16種培養(yǎng)基中馬鈴薯種薯淀粉含量測(cè)定表明添加0.5 mg/L GA+0 mg/L B9時(shí)馬鈴薯種薯淀粉含量最高，1.0 mg/L GA+40 mg/L B9馬鈴薯種薯淀粉含量最低（圖5-B）。

3 討論

圖3 GA與B9對(duì)馬鈴薯結(jié)薯的影響

圖4 GA與B9對(duì)馬鈴薯薯重離散程度的影響

圖5 馬鈴薯淀粉含量的測(cè)定

研究表明，多種激素參與調(diào)控馬鈴薯種薯的形成［4-5，7］，GA在馬鈴薯種薯生長(zhǎng)發(fā)育中的作用很早就被發(fā)現(xiàn)，Vreugdenhil［10］和連勇等［11］認(rèn)為 GA3對(duì)馬鈴薯的塊莖形成有抑制作用。且GA被認(rèn)為在馬鈴薯種薯形成過(guò)程起著主導(dǎo)作用，其他植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是改變GA的水平來(lái)影響種薯的生長(zhǎng)發(fā)育［12］，SD誘導(dǎo)塊莖形成的作用也被認(rèn)為是與其調(diào)節(jié)植株組織中GA含量降低有關(guān)［13］。但在對(duì)SD誘導(dǎo)種薯形成機(jī)制的探究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)GA對(duì)馬鈴薯塊莖形成也可能有促進(jìn)作用［14］。

表3 馬鈴薯結(jié)薯量的方差分析

表4 馬鈴薯莖，葉，芽的方差分析

表5 馬鈴薯淀粉含量的方差分析

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)施加GA與B9探索這兩種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)馬鈴薯種薯生長(zhǎng)發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)GA與B9同時(shí)使用對(duì)馬鈴薯種薯的形成有顯著的影響。在結(jié)薯率方面，當(dāng)GA與B9同時(shí)使用時(shí)，馬鈴薯結(jié)薯數(shù)明顯大于單獨(dú)使用GA和B9（圖3-A）。當(dāng)只施加低濃度的GA時(shí)，馬鈴薯塊莖形成會(huì)受到抑制，但同時(shí)施加B9后塊莖形成會(huì)被促進(jìn)，說(shuō)明馬鈴薯塊莖形成需要一定量的GA參與，也需要GA的抑制劑抑制其功能。這一結(jié)果看似矛盾，但是卻反映出GA對(duì)馬鈴薯塊莖形成的影響不是單一的促進(jìn)或者抑制，而是一個(gè)必要的且作用量存在峰值的過(guò)程。這可以印證許珍等［14］提出的GA對(duì)馬鈴薯塊形成可能有促進(jìn)作用，也印證了 ?ev?íková等［8］發(fā)現(xiàn)的在自發(fā)結(jié)薯馬鈴薯突變體結(jié)薯期GAs含量會(huì)明顯增多的現(xiàn)象。在薯重方面，不同的培養(yǎng)基得到的馬鈴薯薯重也不同，由于1號(hào)、15號(hào)培養(yǎng)基只收到3個(gè)馬鈴薯無(wú)法制作箱圖舍去。其中7號(hào)，8號(hào)，12號(hào)馬鈴薯薯重明顯大于其他培養(yǎng)基（圖3-B），但是馬鈴薯薯重的數(shù)據(jù)離散程度很大，其中7號(hào)培養(yǎng)基結(jié)的馬鈴薯最大達(dá)到1000.3 mg，但其他馬鈴薯重量偏低，所以雖然7號(hào)培養(yǎng)基馬鈴薯均重大，但數(shù)據(jù)不集中（圖4-C）。這可能是由于馬鈴薯植株之間的變異程度大，同一品種的馬鈴薯植株之間可能存在差異［15］。

除了馬鈴薯的結(jié)薯率和薯重，實(shí)驗(yàn)中也探究了GA與B9對(duì)馬鈴薯植株株高、側(cè)芽及葉片的影響，發(fā)現(xiàn)GA對(duì)馬鈴薯株高，葉片數(shù)，莖段高，側(cè)芽數(shù)，側(cè)芽發(fā)生率，側(cè)芽頂芽差都有極顯著的影響；B9對(duì)葉片數(shù)的影響不如GA顯著；GA與B9的交互作用對(duì)馬鈴薯的株高是沒(méi)有影響的，對(duì)葉片數(shù)，莖段數(shù)，側(cè)芽數(shù)，側(cè)芽發(fā)生率，側(cè)芽頂芽高度差都有極顯著的影響的（表4）。表明GA會(huì)促進(jìn)馬鈴薯莖稈的伸長(zhǎng)，側(cè)芽的增多，馬鈴薯塊莖的形成是馬鈴薯匍匐莖莖段膨大的結(jié)果，所以側(cè)芽數(shù)多可能是提高馬鈴薯結(jié)薯率的因素，但是，添加GA的馬鈴薯植株后期葉片弱小，莖稈細(xì)弱，這可能會(huì)影響馬鈴薯的光合作用，影響馬鈴薯的生長(zhǎng)，從而影響馬鈴薯的結(jié)薯率。添加B9會(huì)使馬鈴薯莖稈粗壯，葉片寬大，但是會(huì)減少側(cè)芽的發(fā)生率，所以這也可能是單獨(dú)添加B9的促進(jìn)效果不如B9和GA同時(shí)添加的效果顯著的原因。

馬鈴薯塊莖中約有20%的干物質(zhì)，大部分由淀粉組成［16］，所以淀粉含量是評(píng)價(jià)馬鈴薯質(zhì)量的重要指標(biāo)。馬鈴薯淀粉在工業(yè)加工、食品行業(yè)、房屋筑造等行業(yè)都有廣泛的應(yīng)用［17］。并且馬鈴薯淀粉的許多特性指標(biāo)都已成為行業(yè)內(nèi)的參考標(biāo)準(zhǔn)［18］。已有研究證明GA3處理的葡萄果實(shí)前期會(huì)有淀粉的累積［19］，施用GA會(huì)增加小麥中的淀粉含量［20］，提高ABA與GA的比值，有助于灌漿初期水稻籽粒中淀粉的累積［21］。說(shuō)明GA對(duì)植物中淀粉含量的累積是有影響的。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一定濃度的GA會(huì)促進(jìn)馬鈴薯塊莖淀粉含量的累積，但是高濃度的GA會(huì)降低馬鈴薯塊莖的淀粉含量（表5），這有可能是由于GA會(huì)提升α-淀粉酶的活性，高濃度的GA促使α-淀粉酶將淀粉轉(zhuǎn)換成可溶性糖，將馬鈴薯塊莖中的淀粉合成和降解的平衡打破，加速淀粉降解［22-23］。

馬鈴薯種薯的生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，受多種調(diào)控途徑調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)對(duì)GA與B9對(duì)馬鈴薯種薯生長(zhǎng)發(fā)育的影響進(jìn)行了探究發(fā)現(xiàn)，同時(shí)施用兩種激素會(huì)大幅度提高馬鈴薯的結(jié)薯率，但是GA對(duì)馬鈴薯結(jié)薯影響的分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

通過(guò)在馬鈴薯培養(yǎng)基中添加不同濃度的GA3和B9，對(duì)馬鈴薯的生長(zhǎng)過(guò)程中莖，葉，芽，種薯進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)0.5 mg/L GA與20-40 mg/L B9同時(shí)作用時(shí)馬鈴薯植株生長(zhǎng)良好，馬鈴薯種薯結(jié)薯最多，淀粉含量最高。