降鈣素原(procalcitonin)是反映患者全身炎性反應(yīng)活躍程度的一種蛋白質(zhì)指標(biāo)［1］，在細(xì)菌感染、膿毒癥、臟器功能衰竭等疾病時(shí)血漿中的水平與疾病程度呈正比例升高［2］，因可以有效指導(dǎo)臨床抗生素的使用安全而在臨床中廣泛應(yīng)用［3－4］。目前以電化學(xué)發(fā)光－雙抗體夾心法為主流檢測(cè)方法，價(jià)格較貴，本研究對(duì)膠乳增強(qiáng)免疫比濁法與Roche電化學(xué)發(fā)光－雙抗體夾心法檢測(cè)降鈣素原結(jié)果進(jìn)行分析比較，評(píng)估檢測(cè)成本相對(duì)較低的膠乳增強(qiáng)免疫比濁法在臨床使用的可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料:采用無菌真空采血管采集住院患者新鮮血液標(biāo)本2～3 ml，以3 000 r/min分離血清，依照CLSI EP9－A2用患者樣本進(jìn)行兩種方法比對(duì)及偏倚評(píng)估，選擇的比對(duì)樣本在檢測(cè)方法線性范圍內(nèi)呈低、中、高值均勻分布，并且＞50%的標(biāo)本濃度在正常參考區(qū)間外，兩種檢測(cè)方法均使用留取當(dāng)天的樣本2 h內(nèi)測(cè)定完畢。

1.2 儀器與試劑:兩種方法檢測(cè)均在Roche Cobas8000全自動(dòng)生化免疫分析流水線上進(jìn)行檢測(cè)，參比方法使用Roche原裝進(jìn)口的配套試劑及校準(zhǔn)品，采用的檢測(cè)方法為電化學(xué)發(fā)光－雙抗體夾心法，檢測(cè)范圍是0.02～100 ng/ml，試驗(yàn)方法試劑為寧波美康生物科技有限公司的降鈣素原檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)方法為膠乳增強(qiáng)免疫比濁法，線性范圍是0.05～60 ng/ml。

1.3 方法

1.3.1 方法的選擇:乳膠增強(qiáng)免疫比濁法為試驗(yàn)方法(Y)，電化學(xué)發(fā)光－雙抗體夾心法為比較方法(X)，依據(jù)EP9－A2文件要求進(jìn)行方法間比對(duì)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 樣本檢測(cè):操作者能夠熟練掌握使用儀器設(shè)備，實(shí)驗(yàn)前認(rèn)真做好儀器的保養(yǎng)、校準(zhǔn)、維護(hù)等。做好室內(nèi)質(zhì)控并保證質(zhì)控結(jié)果受控，然后進(jìn)行標(biāo)本的測(cè)定，比對(duì)方法與實(shí)驗(yàn)方法每個(gè)樣本均重復(fù)進(jìn)行2次檢測(cè)。80例患者樣本共得到320個(gè)血清樣本測(cè)定數(shù)據(jù)結(jié)果。

1.3.3 數(shù)據(jù)結(jié)果離群值檢查:以檢測(cè)結(jié)果絕對(duì)差值和相對(duì)差值應(yīng)小于4倍平均絕對(duì)差值和4倍相對(duì)差值平均值作為方法內(nèi)離群點(diǎn)界限;以兩種方法的絕對(duì)差值與相對(duì)差值，小于4倍的絕對(duì)差值平均值和4倍的相對(duì)差值平均值作為方法間離群點(diǎn)判斷界限。

1.3.4 數(shù)據(jù)作圖

1.3.4.1 重復(fù)檢測(cè)均值的散點(diǎn)圖:以試驗(yàn)法雙份測(cè)定的均值對(duì)比較方法雙份測(cè)定的均值的散點(diǎn)圖，Y軸為試驗(yàn)方法即膠乳增強(qiáng)免疫比濁法檢測(cè)的結(jié)果，X軸為比較方法(電化學(xué)發(fā)光－雙抗體夾心法)的結(jié)果。

1.3.4.2 所有結(jié)果的散點(diǎn)圖:以試驗(yàn)方法的每個(gè)檢測(cè)結(jié)果Yij對(duì)比較方法結(jié)果均值作圖。

1.3.4.3 均值差異偏倚圖:以電化學(xué)發(fā)光法為X軸變量(－X)對(duì)(Y+X)/2作圖。

1.3.4.4 單個(gè)結(jié)果差值偏倚圖:(單個(gè)試驗(yàn)方法結(jié)果YIJ－單個(gè)比較方法結(jié)果Xi)對(duì)(試驗(yàn)方法均值比較方法均值2作圖。

1.3.5 X取值范圍合適寬度檢驗(yàn):用兩種方法的直線相關(guān)系數(shù)(r)判斷X的取值范圍是否合適夠?qū)?，如果r≥0.975，則可用線性回歸來統(tǒng)計(jì)斜率和截距［5］，并計(jì)算試驗(yàn)方法線性回歸方程Y=bX+a。

1.3.6 兩種方法偏倚評(píng)價(jià):選定PCT醫(yī)學(xué)決定水平(Xc)的3個(gè)濃度水平0.5 ng/ml、2 ng/ml、10 ng/ml計(jì)算出相應(yīng)的 Bc%和95%可信區(qū)間，按照美國(guó)CLIA'88允許誤差10%為標(biāo)準(zhǔn)，判斷兩種方法偏倚是否可接受。

1.3.7 在PCT醫(yī)學(xué)決定水平0.5 ng/ml、2 ng/ml、10 ng/ml處以比較方法為參考方法計(jì)算兩種方法檢測(cè)結(jié)果的陽性符合率，評(píng)估兩種方法臨床測(cè)定結(jié)果的一致性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS22統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)的比較采用χ2檢驗(yàn)法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。試驗(yàn)方法(Y)和比較方法(X)測(cè)定數(shù)據(jù)在Excel 2007軟件上按照NCCLS EP9－A2文件要求編制相關(guān)函數(shù)公式進(jìn)行計(jì)算分析，軟件自動(dòng)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)并繪制圖表。

2 結(jié)果

(4E)

2.2 數(shù)據(jù)作圖:散點(diǎn)圖1和散點(diǎn)圖2可見，試驗(yàn)方法與比較方法檢測(cè)結(jié)果線性關(guān)系良好，無明顯離群點(diǎn)，數(shù)據(jù)分布均勻;在偏倚圖3、4中可見，兩種方法對(duì)同一份標(biāo)本測(cè)定結(jié)果偏差較小，無明顯離群值，分布合理。

圖2 所有結(jié)果的散點(diǎn)圖

圖3 均值差異與二種方法的均值的偏倚圖

圖4 單個(gè)結(jié)果差值對(duì)兩種方法的均值的偏倚圖

2.3 研究數(shù)據(jù)取值合適范圍的檢驗(yàn):比較方法的(X)的取值合適范圍，可用相關(guān)系數(shù)γ做粗略的估計(jì)。依據(jù)EP9－A2文件給出的r計(jì)算公式得出本研究的r=0.990 92。大于文件要求的r≥0.975的要求，說明本研究數(shù)據(jù)取值范圍合適，回歸方程的斜率和截距可靠。

2.4 直線回歸分析:依據(jù)EP9－A2文件相關(guān)計(jì)算公式，本研究數(shù)據(jù)求得截距(a)=0.037斜率(b)=0.99215，直線回歸方程為Y=0.037+0.992 15X。

2.5 臨床可接受評(píng)價(jià):相對(duì)偏差Bc%=(Bc/Xc)×100%小于1/2CLIA'88相對(duì)允許總誤差(TEa%)表明試驗(yàn)方法的檢測(cè)結(jié)果與比較方法一致，具有可比性。見表1。

2.6 選定 PCT醫(yī)學(xué)決定水平0.5 ng/ml、2 ng/ml、10 ng/ml以比較方法為參考方法計(jì)算兩種方法檢測(cè)值的陽性符合率為95%、96.25%、95.0%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，見表2。

表1 醫(yī)學(xué)決定水平(Xc)偏倚

表2 兩種方法結(jié)果陽性符合率分析

3 討論

目前降鈣素原已在臨床上廣泛的應(yīng)用［6－7］，該項(xiàng)目的檢測(cè)方法有凝膠層析法、高效液相色譜分析法、化學(xué)發(fā)光法、放射免疫分析法、膠乳增強(qiáng)免疫比濁法等。而高效液相色譜分析法與凝膠層析法檢測(cè)過程費(fèi)時(shí)且不易自動(dòng)化，難以在醫(yī)院臨床處理大量常規(guī)標(biāo)本的檢測(cè)，放射免疫分析法(RIA)對(duì)pH、離子強(qiáng)度、反應(yīng)溫度等要求較高，影響因素很多，雖然在操作過程中注意相關(guān)事項(xiàng)，該方法的檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性較好，但是不可回避的是它存在著放射污染問題，且試劑有效期短，影響了其發(fā)展。國(guó)內(nèi)外應(yīng)用廣泛的PCT檢測(cè)分析方法是化學(xué)發(fā)光法，該方法具有高靈敏度，檢測(cè)下限≤0.02 ng/ml，有較寬的測(cè)定范圍0.02～100 ng/ml，檢測(cè)過程不需要任何額外輔助光源，免除了因輔助光源本身穩(wěn)定性、光柵、光波選擇器等的影響，使檢測(cè)結(jié)果靈敏度高、穩(wěn)定可靠、誤差較小，同時(shí)試劑穩(wěn)定期長(zhǎng)。但是電化學(xué)發(fā)光不可避免的問題是試劑成本高，配套的儀器設(shè)備維護(hù)費(fèi)用較高。膠乳增強(qiáng)免疫比濁法操作也是目前較常見的降鈣素原的檢測(cè)使用方法，該方法隨著乳膠顆粒技術(shù)上的優(yōu)化和發(fā)展，特別是納米級(jí)粒子的推出解決了單克隆抗體結(jié)合力不強(qiáng)的問題，使該方法的檢測(cè)線性范圍窄、干擾因素多、實(shí)驗(yàn)室穩(wěn)定差等問題有了顯著的改進(jìn)。本研究中該試驗(yàn)方法的檢測(cè)線性范圍是0.05～60 ng/ml，成本較電化學(xué)發(fā)光－雙抗體夾心法試劑大幅降低，但由于在抗原抗體特異性反應(yīng)時(shí)，生成結(jié)合物的量與反應(yīng)物的濃度有關(guān)，該方法不可避免地會(huì)存在該現(xiàn)象。

不同檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果不一致的情況是一個(gè)普遍存在的問題，也常見很多報(bào)道。引起的原因很多，常見的原因除了方法學(xué)不一致，還因血清中可能含有對(duì)不同的嗜異體等物質(zhì)，引起某些免疫交叉反應(yīng)［8］。此外還有檢測(cè)系統(tǒng)校準(zhǔn)品的溯源性不一致，操作者本身在檢測(cè)過程中未做好校準(zhǔn)、質(zhì)控、試劑穩(wěn)定期、規(guī)范操作等［9］。本研究依據(jù)目前國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用的NCCLS EP9－A2文件［10］要求對(duì)血清PCT檢測(cè)項(xiàng)目在線性范圍內(nèi)，采用國(guó)產(chǎn)的膠乳增強(qiáng)免疫比濁法與電化學(xué)發(fā)光免疫分析法進(jìn)行比較。結(jié)果顯示兩種方法比對(duì)數(shù)據(jù)在方法內(nèi)重復(fù)性、方法間的測(cè)定結(jié)果均無離散點(diǎn)，數(shù)據(jù)分布均勻［11－12］。兩種檢測(cè)方法的相關(guān)系數(shù)r=0.990 92，符合大于文件要求的r≥0.975的要求，直線回歸方程為Y=0.037+0.992 15X，說明本研究數(shù)據(jù)取值范圍合適［13］，回歸方程的斜率和截距可靠，且兩種方法在醫(yī)學(xué)決定水平2 ng/ml、10 ng/ml處的偏倚Bc%＜1/2 CLIA'88允許誤差10%的標(biāo)準(zhǔn)。在醫(yī)學(xué)決定水平0.5 ng/ml的偏倚Bc%相對(duì)較大，主要原因是膠乳增強(qiáng)免疫比濁法的線性范圍0.05～60 ng/ml，相對(duì)比較方法電化學(xué)發(fā)光法的最低檢出限0.02 ng/ml，靈敏度低于比較方法，導(dǎo)致樣本中PCT含量較低的時(shí)候，報(bào)告數(shù)據(jù)產(chǎn)生的差異相對(duì)值大，但是對(duì)于兩個(gè)系統(tǒng)在0.5 ng/ml醫(yī)學(xué)決定水平的臨床陰陽結(jié)果判斷差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，對(duì)細(xì)菌感染的診斷并無影響，所以表明兩種方法偏倚可以接受。以電化學(xué)發(fā)光作為比較方法，兩種方法的陽性符合率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

同時(shí)要注意的是本研究的試驗(yàn)方法其產(chǎn)品說明書上標(biāo)注的試劑開瓶穩(wěn)定期可達(dá)30 d，但該方法檢測(cè)線性范圍是0.05～60 ng/ml，臨床參考限一般設(shè)定＜0.5 ng/ml，由于臨床參考線與該方法最低檢測(cè)限相對(duì)較接近且含量較低，所以在使用過程中要嚴(yán)格保證校準(zhǔn)品的質(zhì)量及校準(zhǔn)頻次。本研究過程中每次檢測(cè)前均進(jìn)行了校準(zhǔn)與質(zhì)控，對(duì)比每次定標(biāo)與不同批次校準(zhǔn)品定標(biāo)后的結(jié)果偏差，同時(shí)要認(rèn)真比較每次校準(zhǔn)的曲線空白值與吸光系數(shù)，如果多點(diǎn)定標(biāo)中校準(zhǔn)液低值接近或低于參考線值時(shí)需要稀釋校準(zhǔn)品中的低值校準(zhǔn)液，或者聯(lián)系廠家提供低值校準(zhǔn)液。某些時(shí)候校準(zhǔn)品由于批次、運(yùn)輸或存儲(chǔ)過程等多方面的影響導(dǎo)致校準(zhǔn)品偏倚較大［14－15］。并且兩者廠家均說明了各自方法對(duì)血清抗干擾的能力如在溶血、黃疸、脂血等方面的程度要求，但是兩種方法的抗干擾能力不同，為避免偏差，本研究統(tǒng)一選擇兩種方法都均不受影響的血清樣本進(jìn)行比對(duì)。綜上所述，在對(duì)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確和快速高效的前提下，相對(duì)較低的成本、簡(jiǎn)便的操作成為檢驗(yàn)用戶及患者的目標(biāo)［8］。本研究中的膠乳增強(qiáng)免疫比濁法與電化學(xué)發(fā)光法，在規(guī)范的質(zhì)量體系和標(biāo)準(zhǔn)的操作程序下均能有效檢測(cè)降鈣素原且相關(guān)性良好，均能滿足臨床需要，適合臨床實(shí)驗(yàn)室推廣使用。