李云攀，劉美云

(1.濰坊護(hù)理職業(yè)學(xué)院，山東 濰坊 262500；2.山東省濰坊市益都中心醫(yī)院，山東 濰坊 262500)

高血壓是一種常見(jiàn)的嚴(yán)重危害人類(lèi)身體健康的心血管疾病，其發(fā)病率和病死率逐年增加，呈年輕化趨勢(shì)顯著，給患者造成極大的醫(yī)療負(fù)擔(dān)[1]。相關(guān)研究表明，血管內(nèi)皮功能障礙是誘發(fā)和加重高血壓病的重要分子機(jī)制，在高血壓病理狀態(tài)下，血管活性物質(zhì)和炎癥介質(zhì)等因素長(zhǎng)期刺激血管壁，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)異常降解和沉積、抗凝和促凝功能紊亂、血管收縮因子和血管舒張因子調(diào)節(jié)失衡，最后引發(fā)血管內(nèi)皮功能障礙[2-4]。

此外，有文獻(xiàn)報(bào)道自噬與血管內(nèi)皮細(xì)胞功能密切相關(guān)，其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、黏附、分泌及血管形成等功能方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[5-7]，而自噬是一把雙刃劍，基礎(chǔ)水平自噬能有效保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能與結(jié)構(gòu)受損，但自噬過(guò)度激活反而會(huì)加重高血壓病情。目前，中藥對(duì)高血壓自噬影響的文獻(xiàn)報(bào)道甚少，且血管內(nèi)皮功能障礙與高血壓自噬之間的發(fā)生機(jī)制亦未見(jiàn)相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，因此，本文擬采用自發(fā)性高血壓模型大鼠，初步探討天麻鉤藤飲對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬相關(guān)信號(hào)通路Ca2+/AMPK/mTOR的影響，以闡述其降壓機(jī)制與調(diào)控自噬的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF級(jí)京都種大鼠(wistarkyoto rat,WKY)10只、自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hyertensive rat,SHR)30只，體重180～220 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為SCXK(京)2012-0001。

1.1.2 藥物 天麻鉤藤飲由天麻9 g、鉤藤12 g、生決明18 g、黃芩9 g、梔子9 g、川牛膝12 g、桑寄生9 g、朱茯神9 g、杜仲9 g、夜交藤9 g、益母草9 g組成，統(tǒng)一購(gòu)自北京同仁堂大藥房并符合國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)，尼莫地平片購(gòu)自天津市中央藥業(yè)有限公司。

1.1.3 試劑 RIPA蛋白抽提試劑、HRP-山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，大鼠ANGⅡ、IL-1 ELISA kit購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，大鼠CaM ELISA kit購(gòu)自武漢華美生物科技有限公司，兔抗大鼠Beclin-1、LC3-Ⅱ、腺苷酸活化蛋白酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)及哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，其余常用試劑均為市場(chǎng)分析純。

1.1.4 儀器 BP98A型無(wú)創(chuàng)血壓檢測(cè)儀(北京軟隆科技有限責(zé)任公司)，GS-800型凝膠掃描成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)，LA612型超純水儀(美國(guó)Elga公司)，PowerPac型電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，5427R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendoff公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 將30只雄性SHR大鼠按體重隨機(jī)分為SHR組、尼莫地平組及天麻鉤藤飲組，另設(shè)正常對(duì)照組(WKY組)，每組10只。參照文獻(xiàn)[8]并按體表面積與人臨床等效劑量換算，中藥組大鼠灌胃給予天麻鉤藤飲生藥10.26 g/kg，西藥組大鼠灌胃給予尼莫地平5.4 mg/kg，WKY組和SHR組大鼠則給予等量蒸餾水，灌胃體積為10 ml/kg，1次/d，連續(xù)給藥6周。

1.2.2 大鼠血壓檢測(cè) 采用BP98A型無(wú)創(chuàng)血壓儀檢測(cè)各組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓，在清醒與非激怒狀態(tài)下，取連續(xù)3次大鼠尾動(dòng)脈收縮壓的平均值作為其血壓，所有大鼠首次給藥前測(cè)定血壓，然后每隔2周于給藥1 h后測(cè)量血壓，并固定每次測(cè)量時(shí)間均在上午。

1.2.3 血漿血管緊張素Ⅱ、白細(xì)胞介素1、鈣調(diào)素含量檢測(cè) 各組動(dòng)物給藥6周后，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血，肝素鈉抗凝，3 000 r/min離心10 min，收集血漿，采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)各組大鼠血漿中ANGⅡ(AngiotensinⅡ,ANG Ⅱ)、IL-(1Interleukin-1,IL-1)及CaM含量(Calmodulin,CaM)，具體操作步驟詳見(jiàn)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.4 自噬標(biāo)志物、微管相關(guān)蛋白輕鏈檢測(cè) 各組動(dòng)物給藥6周后，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，即刻分離胸主動(dòng)脈，置于離心管中，加入PMSF-RIPA(1︰100)試劑抽提總蛋白，12 000 r/min離心10 min，取上清，BCA試劑盒檢測(cè)自噬標(biāo)志物(autophagy-related,Beclin-1)和微管相關(guān)蛋白輕鏈(microtubule-associated protein Ⅱ light chain-3,LC3-Ⅱ)蛋白含量。將蛋白樣本與上樣緩沖液混勻、變性后，以每孔60 μg加入至SDS-PAGE凝膠中，電泳、轉(zhuǎn)膜2.5 h，于搖床5% BSA室溫封閉1 h。加入一抗(Beclin 11︰1 000，LC3-Ⅱ1︰1 000，GAPDH 1︰1 000)4℃培養(yǎng)過(guò)夜，TBST洗3次×10 min，加入HRP-山羊抗兔二抗(1︰1 000)，室溫振搖培養(yǎng)1 h，TBST洗4次×10 min，ECL化學(xué)發(fā)光后通過(guò)蛋白印跡成像和定量分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描，并計(jì)算各蛋白的相對(duì)光密度值。

1.2.5 自噬通路相關(guān)AMPK和mTOR蛋白檢測(cè) 同上操作抽提總蛋白后，離心、取上清，BCA試劑盒測(cè)定AMPK和mTOR蛋白含量，蛋白樣本與上樣緩沖液混合、變性，每孔60μg加入SDS-PAGE凝膠中，電泳、轉(zhuǎn)膜3 h，5% BSA封閉1 h，加入一抗(AMPK 1︰1 000，mTOR 1︰1 000，GAPDH 1︰1 000)4℃培養(yǎng)過(guò)夜，TBST洗3次×10 min，加入HRP-山羊抗兔二抗(1︰1 000)，室溫振搖培養(yǎng)1 h，TBST洗4次×10 min，ECL化學(xué)發(fā)光，最后采用蛋白印跡成像和定量分析系統(tǒng)計(jì)算各蛋白的相對(duì)光密度值。

1.2.6 自噬通路相關(guān)AMPK和mTOR基因檢測(cè) 取各組大鼠胸主動(dòng)脈，分別加入Trizol試劑，參照試劑盒步驟抽提總RNA，采用核酸定量?jī)x測(cè)定其濃度及純度。進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)合成cDNA:42℃60 min、75℃ 5 min，然后擴(kuò)展基因產(chǎn)物:95℃預(yù)變性35 s，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸60 s，共40次循環(huán)。其中內(nèi)參β-actin引物序列正向引物:5'-CATCGCTTGCGGCAGTCACCTG-3'，反向引物:5'-CGTACTGCGTGCGATGAGTCACTT-3'；AMPK引物序列正向引物:5'-CGACGTGGAGCTGTACTGACGT-3'，反向引物:5'-CATACTCAGTCAGATCTCTATC-3'；mTOR引物序列為正向引物:5'-TCGAGTGTTAGCCAC TATAG-3'，反向引物:5'-CCTATTATCGACGCATCCG A-3'。最后以?xún)?nèi)參為對(duì)照計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPFF 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，不同時(shí)間點(diǎn)的各組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓的比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組間的比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 天麻鉤藤飲對(duì)SHR大鼠血壓的影響

4組大鼠給藥前、給藥2周、給藥4周及給藥6周后的血壓值比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果:①不同時(shí)間點(diǎn)的血壓值有差異(F=42.282，P=0.000)；②不同組之間的血壓值有差異(F=10.518，P=0.004)；③不同組之間的血壓值變化趨勢(shì)有差異(F=217.009，P=0.000)。給藥2、4和6周后，與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)WKY組比較，SHR組大鼠血壓增高(t=22.822、31.183和32.482，P=0.009、0.005和0.005)；與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)SHR組比較，尼莫地平組大鼠血壓降低(t=14.342、40.932和20.683，P=0.019、0.003和0.010)，天麻鉤藤飲組大鼠血壓亦降低(t=9.226、11.389和13.494，P=0.039、0.028和0.021)，這提示天麻鉤藤飲對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠具有降壓作用。見(jiàn)表1。

2.2 天麻鉤藤飲對(duì)SHR大鼠血漿ANGⅡ、IL-1及CaM水平的影響

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，給藥6周后，4組大鼠血漿ANGⅡ、IL-1及CaM水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.073、10.052和28.712，P=0.001、0.004和0.000)；與WKY組比較，SHR組大鼠血漿中ANGⅡ、IL-1及CaM含量均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=44.280、25.230和68.112，P=0.000、0.001和0.000)，與SHR組比較，尼莫地平組大鼠血漿ANGⅡ、IL-1及CaM水平均降低(t=18.819、10.415和41.320，P=0.001、0.004和0.000)，天麻鉤藤飲組大鼠上述3個(gè)因子水平亦降低(t=13.374、9.574和7.711，P=0.003、0.009和0.008)，這提示天麻鉤藤飲能有效降低SHR大鼠炎癥水平、抑制血管內(nèi)皮因子過(guò)度激活和細(xì)胞內(nèi)鈣增加。見(jiàn)表2。

表1 天麻鉤藤飲對(duì)SHR大鼠尾動(dòng)脈收縮壓的影響(n =10，mmHg，±s)

表1 天麻鉤藤飲對(duì)SHR大鼠尾動(dòng)脈收縮壓的影響(n =10，mmHg，±s)

注:1)與WKY組比較P ＜0.05；2)與SHR組比較P ＜0.05

組別給藥前給藥2周給藥4周給藥6周SHR組166.2±9.61)182.7±14.31)185.6±11.71)191.5±13.61)尼莫地平組(5.4 mg/kg)167.9±10.41)141.6±12.22)131.3±8.92)145.9±10.82)天麻鉤藤飲組(10.26 g/kg)169.1±11.31)152.1±10.02)156.6±9.22)154.0±11.32)WKY組127.7±8.5135.5±9.4138.4±8.8137.1±9.4

表2 天麻鉤藤飲對(duì)SHR大鼠血漿ANGⅡ、IL-1及CaM水平的影響 (n =10，pg/ml，±s)

表2 天麻鉤藤飲對(duì)SHR大鼠血漿ANGⅡ、IL-1及CaM水平的影響 (n =10，pg/ml，±s)

注:1)與WKY組比較P ＜0.05；2)與SHR組比較P ＜0.05

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2.3 天麻鉤藤飲對(duì)自噬標(biāo)志物Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，給藥6周后，SHR組大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中自噬標(biāo)志物Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)與WKY組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=29.897和27.396，P=0.005和0.006)，SHR組上調(diào)，表明SHR大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中自噬被激活；尼莫地平組大鼠自噬標(biāo)志物Beclin-1蛋白表達(dá)與SHR組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.824，P=0.041)，尼莫地平組降低；天麻鉤藤飲組大鼠Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)均降低(t=22.615和18.340，P=0.009和0.013)，這提示天麻鉤藤飲能有效降低SHR大鼠自噬水平。見(jiàn)圖1。

2.4 天麻鉤藤飲對(duì)AMPK和mTOR表達(dá)的影響

圖1 天麻鉤藤飲對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬標(biāo)志物Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，給藥6周后，WKY組與SHR組大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中自噬通路AMPK和mTOR比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=252.150和47.040，P=0.000和0.002)，SHR組表達(dá)上調(diào)；與SHR組比較，尼莫地平組大鼠自噬通路相關(guān)AMPK和mTOR蛋白表達(dá)降低(t=43.320和18.732，P=0.003和0.012)，天麻鉤藤飲組大鼠AMPK和mTOR蛋白表達(dá)亦降低(t=147.001和21.689，P=0.000和0.009)，這提示天麻鉤藤飲對(duì)自噬通路相關(guān)AMPK和mTOR蛋白具有調(diào)控作用。見(jiàn)圖2。

2.5 天麻鉤藤飲對(duì)自噬通路相關(guān)AMPK和mTOR基因表達(dá)的影響

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，給藥6周后，4組大鼠AMPK和mTOR基因表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.482和8.126，P=0.004和0.008)；WKY組與SHR組大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬通路相關(guān)AMPK和mTOR mRNA比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=26.113和22.601，P=0.001和0.002)，SHR組表達(dá)上調(diào)；與SHR組比較，尼莫地平組大鼠自噬通路相關(guān)AMPK和mTOR mRNA表達(dá)均降低(t=14.530和9.125，P=0.003和0.011)，天麻鉤藤飲組大鼠上述兩基因表達(dá)水平亦降低(t=7.769和9.654，P=0.011和0.008)，這提示天麻鉤藤飲對(duì)自噬通路相關(guān)AMPK和mTOR基因具有明顯的調(diào)控作用。見(jiàn)表3。

圖2 天麻鉤藤飲對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬通路相關(guān)AMPK和mTOR蛋白表達(dá)的影響

表3 天麻鉤藤飲對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬通路相關(guān)AMPK、mTOR基因表達(dá)的影響 (n =10，±s)

表3 天麻鉤藤飲對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬通路相關(guān)AMPK、mTOR基因表達(dá)的影響 (n =10，±s)

注:1)與WKY組比較P ＜0.05；2)與SHR組比較P ＜0.05

組別AMPKmTOR SHR組1.637±0.2721)1.432±0.1871)尼莫地平組(5.4 mg/kg)0.924±0.1762)1.015±0.1492)天麻鉤藤飲組(10.26 g/kg)1.073±0.2212)0.987±0.1632)WKY組0.729±0.1440.842±0.106

3 討論

自噬是指細(xì)胞內(nèi)受損、變性及衰老的蛋白和細(xì)胞碎片被運(yùn)輸?shù)饺苊阁w，并對(duì)其進(jìn)行消化降解，以胞質(zhì)內(nèi)自噬體出現(xiàn)為標(biāo)志的一種程序化的細(xì)胞自我降解過(guò)程[9]。在此過(guò)程中Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白是哺乳動(dòng)物自噬相關(guān)基因的編碼產(chǎn)物，兩者通過(guò)與哺乳動(dòng)物空泡序列蛋白質(zhì)34(mammalian Vacuolar sorting proteins-34,mVps-34)、B細(xì)胞淋巴瘤蛋白2(B Cell Leukemia-2,Bcl-2)等因子相互作用，激活細(xì)胞自噬，故Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白常常作為自噬標(biāo)志分子來(lái)檢測(cè)細(xì)胞自噬水平[10]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮功能障礙與高血壓病的發(fā)生密切相關(guān)，并且是后者的重要致病因素，在高血壓病理進(jìn)程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞與循環(huán)血液內(nèi)高濃度的AngⅡ直接接觸，刺激產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)、IL-1、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎癥因子及細(xì)胞內(nèi)鈣離子[11-12]，而當(dāng)Ca2+超載后，血漿中鈣調(diào)素CaM增加，又可激活鈣/鈣調(diào)蛋白激酶依賴(lài)性激酶β(Ca2+/calmodulin-dependent kinase kinase β，CaMKK-β)增加AMPK活性，然后磷酸化結(jié)節(jié)蛋白復(fù)合物2(tuberous sclerosis complex-2,TSC-2)進(jìn)而抑制重組人表皮因子(reconstructed human epidermis,RHE)分子，通過(guò)負(fù)反饋抑制mTOR活性，最終激活細(xì)胞自噬[13-15]，因此自噬與高血壓發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，其可通過(guò)Ca2+/AMPK/mTOR信號(hào)途徑導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞壞死與凋亡，進(jìn)而加重高血壓病情。

天麻鉤藤飲源自《雜病證治新義》，是目前臨床上一種治療高血壓病的經(jīng)典方，由天麻、鉤藤、生決明、黃芩、梔子、川牛膝、桑寄生、朱茯神、杜仲、夜交藤、益母草幾味藥組成，方中天麻、鉤藤平肝熄風(fēng)，石決明平肝潛陽(yáng)，黃芩、梔子清肝降火，川牛膝活血利水，桑寄生、杜仲補(bǔ)肝益腎，朱茯神、夜交藤寧心安神，諸藥合用，共奏平肝熄風(fēng)、清熱活血、補(bǔ)益 肝腎之功效[8，16]。臨床研究表明，其降壓效果顯著，并能抑制患者細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放、降低血漿內(nèi)皮素(Endothelin,ET)、ANGⅡ含量及超敏C反應(yīng)蛋白(high-sensitivity C-reactive protein,hs-CRP)、TNF-α等炎癥因子水平，有效改善高血壓患者受損的血管內(nèi)皮功能及血管重塑[17]。本文實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，尼莫地平、天麻鉤藤飲均能降低SHR大鼠尾動(dòng)脈收縮壓和血漿ANGⅡ和CaM水平、下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞中自噬標(biāo)志物Beclin-1和LC3-Ⅱ與自噬通路相關(guān)AMPK和mTOR蛋白及mRNA表達(dá)水平，這些結(jié)果提示抑制自噬相關(guān)信號(hào)通路與天麻鉤藤飲降壓機(jī)制存在一定的聯(lián)系。已知陽(yáng)性藥尼莫地平屬于鈣通道拮抗劑，研究表明其能有效降低SHR大鼠血壓[18-19]，且尼莫地平可通過(guò)阻斷Ca2+/AMPK/mTOR信號(hào)通路從而抑制細(xì)胞自噬[20]，這提示天麻鉤藤飲可能也是通過(guò)調(diào)控Ca2+/AMPK/mTOR相關(guān)自噬信號(hào)通路而發(fā)揮降壓作用的。

綜上所述，天麻鉤藤飲對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬相關(guān)信號(hào)通路Ca2+/AMPK/mTOR具有明顯的調(diào)控作用，其中藥整體降壓作用與調(diào)控自噬密切相關(guān)，推測(cè)天麻鉤藤飲通過(guò)降低ANGⅡ、IL-1等血管活性與炎癥介質(zhì)，然后抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載，繼而阻斷Ca2+/AMPK/mTOR自噬信號(hào)途徑，這可能是天麻鉤藤飲抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬發(fā)揮降壓作用的重要機(jī)制之一，但其具體機(jī)制仍有待明確，后續(xù)實(shí)驗(yàn)計(jì)劃采用AMPK、mTOR受體阻斷劑與激動(dòng)劑，并從藥物不同作用時(shí)間點(diǎn)對(duì)其進(jìn)行更深層次的機(jī)制研究。