(錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001)

神經(jīng)遷移因子(Slit)及其跨膜受體蛋白(Roundabout,Robo)屬于神經(jīng)導(dǎo)向因子，兩者最初是在果蠅中被檢測到并在其神經(jīng)系統(tǒng)篩選、克隆成功[1-2]。在哺乳動物中，Slit有3種亞型，Slit1、Slit2及Slit3。Robo有4種亞型，Robo1、Robo2、Robo3及Robo4。其中，Slit2蛋白廣泛表達于神經(jīng)組織、泌尿系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)[3-4]；Robo1在神經(jīng)、肺、肝臟、腎臟及心臟中均有表達[5-6]。實驗研究顯示Slit和Robo在神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達，并參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程；在非神經(jīng)系統(tǒng)如肺、腎臟、心臟、卵巢、血管、性腺及乳腺等多個器官組織的發(fā)育過程中同樣發(fā)揮重要作用[7-8]。本研究采用免疫組織化學(xué)技術(shù)和蛋白印跡技術(shù)對Slit2及其受體Robo1在小鼠腎發(fā)育中的表達進行系統(tǒng)觀察和定量分析，為后續(xù)探討其在腎發(fā)育中的作用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 中國昆明系清潔級小鼠90只[成年小鼠12～22 g，其余各胚(日)齡未測量體重]購自錦州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[醫(yī)動字第SCXY(遼)2013-2017號]。

1.1.2 實驗試劑 Slit2兔多克隆抗體和Robo1兔多克隆抗體購自上海斯信生物科技有限公司提供，免疫組織化學(xué)試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine,DAB)顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物公司，3-磷酸甘油醛脫氫(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)鼠單克隆抗體購自上?？党缮锕こ逃邢薰?。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)本復(fù)制 成年雄、雌性小鼠合籠培育孕鼠。共9組，不同時間點各取10只。取胚齡(embryonic days,E)12 d胎鼠全胚；胚齡14 d至生后日齡(neonatal days,N)40 d小鼠腎臟，常規(guī)制備石蠟組織切片并提取蛋白。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 切片脫蠟后，依次入100%乙醇2次，90%、80%和70%乙醇各1次，每次10 min，流水沖洗。配置枸櫞酸鈉修復(fù)液，加熱至沸騰，切片完全浸入修復(fù)液，高壓修復(fù)抗原2 min，室溫自然冷卻。取切片置于濕盒內(nèi)，滴加3%過氧化氫反應(yīng)10 min。滴加正常山羊血清封閉液反應(yīng)1 h，輕輕甩去封閉液。滴加Slit2(1︰150)或Robo1(1︰150)4℃過夜。滴加聚合物輔助劑，37℃ 30 min。滴加辣根酶標(biāo)記抗兔免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,IgG)聚合物，37℃ 30 min。滴加DAB顯色液，光學(xué)顯微鏡監(jiān)測組織顯色情況。當(dāng)鏡下可見明顯棕黃色時，切片放入蒸餾水以終止顯色。蘇木精復(fù)染細胞核。

1.2.3 蛋白印跡檢測 腎臟經(jīng)超聲粉碎機粉碎，加適量裂解液裂解，低溫離心30 min，抽取上層液體，蛋白定量，分裝。安裝固定膠板，配膠，灌膠。蛋白樣品及內(nèi)參經(jīng)加熱變性后加樣。電泳分離(濃縮膠電壓90 V，分離膠電壓120 V)。轉(zhuǎn)膜(電壓50 V，室溫2 h)。5%脫脂奶粉封閉1 h。一抗Slit2(1︰500)或Robo1(1︰500)4℃孵育過夜。Tween20-Tris緩沖鹽溶液(Tween20-Tris Buffered Saline,TTBS)洗膜30 min。二抗(1︰2 000)室溫孵育2 h，TTBS洗膜30 min。發(fā)光溶液A、B各15 ml避光混勻，加至膜上，凝膠電泳圖像分析儀拍照。以內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)，測定條帶光密度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

Slit2在胚齡12 d小鼠腎臟的生腎區(qū)開始表達。其中，Slit2在小鼠輸尿管芽及其周圍的間充質(zhì)聚集的部位陽性表達，其余部位無廣泛表達。在腎單位發(fā)育過程中，Slit2定位表達于逗號小體階段和S小體階段，且表達較強。在Ⅲ和Ⅳ期腎小體階段及成熟腎小體階段有微弱的表達。Slit2在腎臟泌尿小管如近端小管、遠端小管及集合管發(fā)育過程中均有表達。見圖1～4。

圖1 Slit2在輸尿管芽和生后腎組織的表達(免疫組織化學(xué)染色×400)

圖2 Slit2在腎小體發(fā)育各階段的表達 (免疫組織化學(xué)染色×400)

圖3 Slit2在腎小管的表達(免疫組織化學(xué)染色×400)

圖4 Slit2在集合管的表達(免疫組織化學(xué)染色×400)

Robo1在胚齡12 d小鼠腎臟的生腎區(qū)開始表達。Robo1在小鼠生腎區(qū)廣泛表達，主要分布于生后腎組織和輸尿管芽上皮細胞基底面。在腎單位發(fā)育過程中，Robo1定位于逗號小體階段、S小體階段、Ⅲ和Ⅳ期腎小體階段，且表達較強，在成熟腎小體階段表達微弱。Robo1在小鼠腎臟泌尿小管如近端小管、遠端小管及集合管發(fā)育過程中均有表達，主要分布于泌尿小管上皮細胞的基底面。見圖5～8。

圖5 Robo1在輸尿管芽和生后腎組織的表達(免疫組織化學(xué)染色×400)

圖6 Robo1在腎小體發(fā)育各階段的表達 (免疫組織化學(xué)染色×400)

2.2 蛋白印跡檢測結(jié)果

從小鼠胚齡14 d開始，Slit2蛋白表達隨著胚(日)齡的增加，先呈現(xiàn)遞增，胚齡16 d達峰值，隨后遞減。其中，Slit2蛋白表達在出生后1、7和40 d下調(diào)較為明顯(F=16.564，P=0.012)(見圖9)。Robo1蛋白表達隨著胚(日)齡的增加而遞減，在胚齡18 d、出生后1和14 d下調(diào)較為明顯；出生后一直維持低水平表達(F=13.483，P=0.016)。見圖10。

圖7 Robo1在腎小管內(nèi)的表達 (免疫組織化學(xué)染色×400)

圖8 Robo1在集合管的表達 (免疫組織化學(xué)染色×400)

圖9 Slit2在小鼠腎臟發(fā)育各階段的表達

圖10 Robo1在小鼠腎臟發(fā)育各階段的表達

3 討論

本研究顯示，Slit2在胚齡12 d小鼠的輸尿管芽及輸尿管芽周圍的間充質(zhì)聚集部位開始有陽性表達，其余部位未見表達。而Robo1在生腎區(qū)廣泛表達，主要分布于生后腎組織和輸尿管芽上皮細胞基底面。說明Slit2及其受體Robo1在小鼠腎臟早期發(fā)育即輸尿管芽的發(fā)生階段就開始發(fā)揮作用。且之前研究報道也稱Slit2基因敲除小鼠胚胎腎臟表現(xiàn)為多個輸尿管芽，從而產(chǎn)生多個腎臟，說明Slit2對于輸尿管芽的萌出起到關(guān)鍵的調(diào)控作用，其表達異?；蚧蛉笔绊戄斈蚬苎康恼０l(fā)生過程[9-10]。在腎小體發(fā)育過程中，Slit2及其受體Robo1均有陽性表達。Slit2定位表達于逗號小體階段和S小體階段，且表達較強；在Ⅲ和Ⅳ期腎小體階段及成熟腎小體階段有微弱的表達。Robo1定位表達于逗號小體階段、S小體階段、Ⅲ和Ⅳ期腎小體階段，且表達較強，在成熟腎小體階段有微弱的表達。兩者的表達部位一致，提示Slit2及其受體Robo1參與調(diào)控腎小體發(fā)生發(fā)育的全部過程。另有報道稱Robo受體家族中的Robo2表達于成熟腎小體的足細胞[11]。在糖尿病腎病患者腎小球中Robo2表達量下調(diào)，提示Robo2可能與腎臟腎小體足細胞功能的維持有關(guān)，參與調(diào)控足細胞的黏附力[12]。而本研究結(jié)果顯示Robo1未見在足細胞表達，表明其可能對足細胞的發(fā)育和功能作用不大。Slit2和Robo1在腎臟泌尿小管(近端、遠端小管及集合管)發(fā)育和成熟階段均明顯表達?？梢?，Slit2及其受體Robo1不僅參與腎小管和集合管的形態(tài)發(fā)生發(fā)育過程，對其功能維持也起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。半定量分析結(jié)果表明，Slit2蛋白表達量隨著胚(日)齡的增加，先呈現(xiàn)遞增，胚齡16 d達峰值，隨后遞減。Robo1蛋白表達隨著小鼠胚(日)齡的增加而遞減，兩者略有差異，但生后兩者的變化趨勢基本一致。蛋白印跡檢測結(jié)果提示Slit2及其受體Robo1在生后表達較低，這可能與腎臟中腎小體的發(fā)育規(guī)律有關(guān)。對小鼠腎臟而言，腎小體的發(fā)育成熟主要集中在胚齡14 d到生后7 d。在生后7 d，隨著生腎區(qū)的消失，腎小體發(fā)育成熟，數(shù)目不再增加[13]。而本研究結(jié)果提示，Slit2和Robo1主要在發(fā)育過程中的腎小體表達明顯，而在成熟腎小體微弱表達?？梢?，Slit2和Robo1的蛋白表達變化規(guī)律與腎小體的發(fā)育規(guī)律是一致的。前期試驗證實，膠質(zhì)細胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell linederived neurotrophic factor,GDNF)/GDNF家族受體α1(GDNF family receptor α1,GFRα1)/受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RET)信號通路參與調(diào)控小鼠腎臟發(fā)育[14]。根據(jù)文獻報道，GDNF調(diào)控輸尿管芽發(fā)生、發(fā)育。而在Robo2小鼠體內(nèi)后腎間充質(zhì)出現(xiàn)GDNF表達區(qū)域擴大，多個輸尿管芽發(fā)生的現(xiàn)象[15]。提示這2個信號系統(tǒng)可能存在關(guān)聯(lián)，Slit/Robo信號通路是否通過調(diào)控GDNF的表達來影響腎臟的早期發(fā)育，這些都需要進一步的實驗進行驗證。

綜上所述，Slit2及其受體Robo1在腎臟發(fā)生和發(fā)育過程中有廣泛表達，如后腎發(fā)生階段出現(xiàn)的輸尿管芽、生后腎組織、各期腎小體、發(fā)育及成熟階段的泌尿小管(近端小管、遠端小管及集合管)?？梢姡琒lit2及其受體Robo1對于腎臟的發(fā)生階段、中后期的分化階段及成熟后的功能維持階段均可發(fā)揮一定的作用。結(jié)合相關(guān)文獻報道，有理由推測Slit2及其受體Robo1是腎臟發(fā)生、發(fā)育的必備調(diào)控因素，其表達異常會導(dǎo)致腎發(fā)育畸形及功能異常，從而引發(fā)相關(guān)臨床癥狀。本研究不僅為闡明腎發(fā)育畸形的可能機制提供理論依據(jù)，同時也為腎發(fā)育畸形的臨床診斷、治療和預(yù)防提供思路。另外，本研究結(jié)果對Slit2及其受體Robo1在腎臟的表達進行系統(tǒng)觀察和定位，也為后續(xù)的深入探究Slit2及其受體Robo1的功能提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)。相信隨著研究的不斷推進，對腎發(fā)育畸形的發(fā)病機制將有更全面的認識和了解。