楊光，鄭如意，董程驥，陳夢(mèng)茜，金在順

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江157011；2.江蘇省徐州市礦山醫(yī)院，江蘇 徐州221006)

套細(xì)胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma,MCL)是非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin lymphoma,NHL)中的一種亞型，約占全部NHL的6%[1]。免疫表型為成熟的B細(xì)胞表型，即細(xì)胞表面表達(dá)有大量的CD20和CD5抗原[2-3]。由于其惡性程度高、侵襲速度快[4]，因此MCL的早期診斷及早期治療成為延長(zhǎng)生存期的關(guān)鍵。

上轉(zhuǎn)換納米顆粒(upconversion nanoparticles,UCNPs)作為一種新型的熒光標(biāo)志物，具有上轉(zhuǎn)換功能強(qiáng)大、檢測(cè)敏感性高[5-7]、化學(xué)穩(wěn)定性好以及細(xì)胞毒性很低等[8]一系列優(yōu)點(diǎn)，在980 nm近紅外光(near infrared,NIR)激發(fā)下將釋放出明亮的上轉(zhuǎn)換熒光(upconversion fluorescence,UCL)?；诳乖?、抗體之間的特異性免疫反應(yīng)原理，本研究將采用UCNPs與相應(yīng)抗體偶聯(lián)的方法，使該粒子具有靶向性，進(jìn)而對(duì)MCL細(xì)胞株進(jìn)行靶向成像?，F(xiàn)將對(duì)UCNPs在MCL細(xì)胞靶向成像中的應(yīng)用進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑 NaYF4:Er3+和NaYF4:Yb3+，Tm3+納米顆粒由牡丹江醫(yī)學(xué)院電鏡室提供，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)購(gòu)自北京亞太恒信生物科技有限公司，2-嗎啉乙磺酸(2-morpholinoethanesulfonic acid,MES,99%)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸酸[1-(3-dimethy laminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC·HCl,98%]、N-羥基硫代琥珀酰亞胺(N-Hydroxysuccinimide,NHS,98%)購(gòu)自上海阿拉丁試劑公司，RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，雙氧水(H2O2，30%)購(gòu)自遼寧泉瑞試劑有限公司，CD20(Clone:2H7)和CD5(Clone:UCHT2)單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)BD生物科技公司，Jeko-1細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.2 儀器 Night OWL小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)購(gòu)自德國(guó)Berthold公司，Eclipse Ti-S倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本尼康公司，傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜儀(fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，WG1233B3-980 nm半導(dǎo)體激光系統(tǒng)購(gòu)自北京艾納捷光電科技有限公司，超聲波細(xì)胞破碎儀購(gòu)自寧波新芝生物科技股份有限公司，溫控磁力攪拌器購(gòu)自常州普天儀器制造有限公司，CO2培養(yǎng)箱、離心機(jī)和微量移液槍均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，Statspin Cytofuge 12細(xì)胞甩片機(jī)購(gòu)自北京自然基因科技有限公司。

1.2 納米顆粒疏水性向親水性的轉(zhuǎn)化

雙氧水作為一種強(qiáng)氧化劑，對(duì)納米顆粒表面油酸鹽配體碳碳雙鍵進(jìn)行直接氧化。通過(guò)該方法可將有疏水特性的納米顆粒轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性。將0.1 g預(yù)先制備好的NaYF4:Yb3+，Tm3+納米顆粒和8 ml的H2O2混勻，在室溫下磁力攪拌1 h。氧化結(jié)束后，通過(guò)離心棄除上清液。氧化后的沉淀加入去離子水在超聲波細(xì)胞破碎儀下充分粉碎洗滌，之后離心，最后將沉淀在70℃恒溫箱中干燥24 h。使用同樣的方法NaYF4:Er3+納米粒子也由最初的親水性轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷浴?/p>

1.3 氧化后的納米顆粒與CD20/CD5抗體偶聯(lián)

取氧化后的NaYF4:Yb3+，Tm3+納米顆粒0.05 g，向其中加入MES并將混合液在超聲波細(xì)胞破碎儀的作用下充分粉碎5 min。超聲降解粉碎機(jī)功率為600 W。在轉(zhuǎn)速4 000 r/min的條件下離心，棄除上清液。然后向沉淀中加14 ml MES、0.005 g EDC、0.015 g NHS在室溫下磁力攪拌2 h。磁力攪拌結(jié)束后，將混合液離心、去除上清液。再向沉淀中加入PBS在超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)作用下充分粉碎洗滌2次，離心、去上清液并向沉淀中加5 ml PBS和50 μl CD5單克隆抗體(1:100稀釋)，將其放在搖床上振蕩2 h。最后將加入抗體的混合液放在4℃冰箱保存?zhèn)溆?。即連接有CD5抗體的NaYF4:Yb3+，Tm3+納米粒子成功制備。使用同樣的方法，偶聯(lián)有CD20單克隆抗體的NaYF4:Er3+納米探針也成功制備。

1.4 UCNPs上轉(zhuǎn)換性能檢測(cè)及傅里葉波譜分析

取適量偶聯(lián)有相應(yīng)抗體的UCNPs懸液，使用配備有980 nm近紅外激光的Night OWL小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行成像。激發(fā)功率分別為0、0.7和1.0 W，以此來(lái)驗(yàn)證UCNPs的發(fā)光性能。取僅僅氧化后的，與NHS、EDC反應(yīng)后的以及與相應(yīng)抗體偶聯(lián)后的UCNPs，使用FT-IR對(duì)其進(jìn)行波譜分析，以此間接驗(yàn)證該粒子最終是否已被成功的生物功能化以及是否已與相應(yīng)的抗體成功偶聯(lián)。

1.5 UCNPs細(xì)胞毒性檢測(cè)

吸取200 μl Jeko-1細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù):6.3×105個(gè))接種到24孔培養(yǎng)板內(nèi)，共接種15個(gè)孔。其中實(shí)驗(yàn)組12個(gè)孔，對(duì)照組3個(gè)孔。然后向15個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)分別加800 μl含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)組中的12個(gè)培養(yǎng)孔每4個(gè)孔為一組，共分為3組。每組分別滴加20、40、80、160 μl UCNPs懸液。將24孔培養(yǎng)板在37℃、CO2濃度為5% 的條件下分別培養(yǎng)24、48和72 h。在不同的時(shí)間點(diǎn)使用臺(tái)盼藍(lán)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色并利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。通過(guò)以下公式計(jì)算細(xì)胞活性進(jìn)而評(píng)估UCNPs的細(xì)胞毒性:細(xì)胞活性(%)=(實(shí)驗(yàn)組活細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組活細(xì)胞數(shù))×100%。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)和成像

細(xì)胞在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度為37℃、CO2濃度為5%。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞用于該實(shí)驗(yàn)。為了使細(xì)胞均勻的分布于載玻片上，吸取Jeko-1細(xì)胞懸液100 μl(細(xì)胞數(shù):1.5×105個(gè))加入細(xì)胞甩片機(jī)加樣孔內(nèi)，1 000 r/min離心5 min，使細(xì)胞均勻分布于載玻片。丙酮固定細(xì)胞后，向Jeko-1細(xì)胞所在區(qū)域滴加CD20抗體NaYF4:Er3+納米探針懸液和CD5抗體NaYF4:Yb3+，Tm3+納米探針懸液的混合液300 μl，室溫下濕盒內(nèi)孵育2 h。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，向Jeko-1細(xì)胞所在區(qū)域滴加NaYF4:Er3+納米探針懸液和CD5抗體NaYF4:Yb3+，Tm3+納米探針懸液的混合液300 μl；向Jeko-1細(xì)胞所在區(qū)域滴加CD20抗體NaYF4:Er3+納米探針懸液和NaYF4:Yb3+，Tm3+納米探針懸液的混合液300 μl；向Jeko-1細(xì)胞所在區(qū)域滴加NaYF4:Er3+納米探針懸液和NaYF4:Yb3+，Tm3+納米探針懸液的混合液300 μl，在同樣的條件下進(jìn)行孵育。孵育結(jié)束后用PBS充分洗滌3次，徹底去除多余的、沒(méi)有和細(xì)胞結(jié)合的納米探針，使用配備有980 nm近紅外激光的尼康Eclipse Ti-S倒置熒光顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞成像。

2 結(jié)果

2.1 UCNPs細(xì)胞毒性及上轉(zhuǎn)換性能

為了探究UCNPs的細(xì)胞毒性，使用臺(tái)盼藍(lán)對(duì)Jeko-1細(xì)胞染色的方法來(lái)確定不同量的UCNPs與細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間后其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)所產(chǎn)生的影響。設(shè)定UCNPs探針懸液體積梯度，即20、40、80和160 μl，在同樣的生理?xiàng)l件下分別與Jeko-1細(xì)胞培養(yǎng)24、48和72 h，然后進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色、活細(xì)胞計(jì)數(shù)，并計(jì)算細(xì)胞活性。由圖1A可見(jiàn)，隨著UCNPs探針懸液體積的增加以及UCNPs探針與細(xì)胞孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，各組細(xì)胞的細(xì)胞活性幾乎均處于90%以上，并未發(fā)生明顯的降低。同時(shí)，將臺(tái)盼藍(lán)溶液與細(xì)胞懸液按1:1的比例混勻，然后將混合液加入血球計(jì)數(shù)板內(nèi)，通過(guò)倒置顯微鏡直觀的觀察活細(xì)胞的比例。由于已經(jīng)死亡的細(xì)胞可以被臺(tái)盼藍(lán)染為深藍(lán)色，見(jiàn)圖1B可見(jiàn)，可以看出血球計(jì)數(shù)板內(nèi)死細(xì)胞數(shù)是非常的少，而透亮的活細(xì)胞則占較高比例。此外，為進(jìn)一步明確UCNPs的上轉(zhuǎn)換性能的高效性，吸取少量偶聯(lián)有相應(yīng)抗體的UCNPs懸液，通過(guò)使用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)對(duì)粒子探針的上轉(zhuǎn)換發(fā)光性能進(jìn)行檢測(cè)。由圖2可見(jiàn)，在未給予近紅外光激發(fā)的情況下，UCNPs并未產(chǎn)生UCL。然而當(dāng)近紅外光的激發(fā)功率達(dá)到0.7 W時(shí)，UCNPs探針懸液卻釋放出明亮的UCL。并且通過(guò)肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，隨著近紅外光激發(fā)功率的增加(P=1 W)，該探針?biāo)a(chǎn)生的UCL的強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)。

圖1 UCNPs細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果

圖2 UCNPs懸液的上轉(zhuǎn)換成像

2.2 UCNPs的表面氧化及生物功能化

由于最初的UCNPs表面被油酸所包覆，因而其表現(xiàn)為疏水特性。為了使其具有水溶性，使用H2O2對(duì)粒子表面油酸配體上的碳碳雙鍵(R-HC=CH-R’)進(jìn)行氧化，以此形成帶有更多羧基(-COOH)的壬二酸。為了確定UCNPs是否已與單克隆抗體成功偶聯(lián)，采用一種間接的檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，即使用傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜儀(FT-IR)對(duì)粒子進(jìn)行波譜分析檢測(cè)。見(jiàn)圖3，a、b、c分別代表僅僅氧化后UCNPs、與NHS、EDC反應(yīng)的UCNPs和與單克隆抗體反應(yīng)后的UCNPs的波譜?？梢钥闯霾〝?shù)在2 849 cm-1和2 926 cm-1處，a、b、c所代表的3種經(jīng)過(guò)不同處理的粒子的吸收峰強(qiáng)度逐漸下降。

圖3 UCNPs的FT-IR波譜分析結(jié)果

2.3 細(xì)胞免疫標(biāo)志和成像

在這項(xiàng)研究中，由于細(xì)胞表面的抗原與UCNPs上偶聯(lián)的單克隆抗體之間發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)，Jeko-1細(xì)胞得以被特異性的識(shí)別標(biāo)志。抗體的羧基基團(tuán)和納米粒子表面的氨基基團(tuán)在NHS和EDC的輔助下將發(fā)生冷凝反應(yīng)[9]，進(jìn)而UCNPs與單克隆抗體發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，見(jiàn)圖4。因此根據(jù)以上原理，氧化后的NaYF4:Yb3+，Tm3+納米顆粒與CD5抗體發(fā)生交聯(lián)進(jìn)而牢固連接形成CD5抗體-UCNPs軛合物，同樣CD20抗體通過(guò)該方法與NaYF4:Er3+納米粒子共價(jià)結(jié)合形成CD20抗體-UCNPs軛合物。基于Jeko-1細(xì)胞表面表達(dá)大量CD20和CD5抗原，以及細(xì)胞表面的抗原與納米顆粒上的抗體之間發(fā)生的特異性免疫反應(yīng)，Jeko-1細(xì)胞能夠被NaYF4:Yb3+，Tm3+UCNPs和NaYF4:Er3+UCNPs特異性標(biāo)志。

為了通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)功能化后的UCNPs可以對(duì)Jeko-1細(xì)胞進(jìn)行免疫標(biāo)志，將Jeko-1細(xì)胞與UCNPs-CD20抗體軛合物和UCNPs-CD5抗體軛合物的混合液室溫孵育2 h，再使用PBS對(duì)細(xì)胞充分清洗以除去未與細(xì)胞結(jié)合的殘存粒子。然后使用配備有980 nm近紅外激光的共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行上轉(zhuǎn)換成像，激發(fā)功率為1.5 W，曝光時(shí)間為2 s。由圖5可見(jiàn)，將明場(chǎng)像和暗場(chǎng)像進(jìn)行重疊，細(xì)胞的形狀和位置并未發(fā)生任何改變。在×20物鏡下發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞表面釋放明亮的藍(lán)、綠雙色UCL，且釋放雙色熒光的UCNPs在細(xì)胞表面分布的部分區(qū)域并未發(fā)生重疊，同時(shí)在細(xì)胞外區(qū)域也未見(jiàn)殘存的發(fā)光粒子，這意味著UCNPs的確僅僅分布于細(xì)胞上。

圖4 細(xì)胞的免疫標(biāo)志

圖5 Jeko-1細(xì)胞與NaYF4:Er3+-CD20抗體和NaYF4:Yb3+，Tm3+-CD5抗體共同孵育后上轉(zhuǎn)換熒光圖像 (20 μm)

進(jìn)一步驗(yàn)證是否細(xì)胞與UCNPs之間的連接是基于抗原/抗體介導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)。在同樣的孵育條件下，將Jeko-1細(xì)胞與NaYF4:Er3+納米探針懸液和CD5抗體NaYF4:Yb3+，Tm3+納米探針懸液的混合液共同孵育。在UCNPs未與CD20抗體偶聯(lián)的情況下與Jeko-1細(xì)胞共同孵育后，細(xì)胞表面僅可見(jiàn)NaYF4:Yb3+，Tm3+釋放明亮的藍(lán)色UCL，而未見(jiàn)NaYF4:Er3+所釋放的綠色熒光(見(jiàn)圖6)。此外，將Jeko-1細(xì)胞與CD20抗體NaYF4:Er3+納米探針懸液和NaYF4:Yb3+，Tm3+納米探針懸液的混合液共同孵育，一定時(shí)間后進(jìn)行UCL成像。UCNPs在未與CD5抗體偶聯(lián)的情況下與Jeko-1細(xì)胞共同孵育后，細(xì)胞表面僅可見(jiàn)NaYF4:Er3+釋放的明亮的綠色UCL，而未見(jiàn)NaYF4:Yb3+，Tm3+釋放的藍(lán)色UCL(見(jiàn)圖7)。最后將Jeko-1細(xì)胞與未偶聯(lián)任何抗體的NaYF4:Er3+納米探針懸液和NaYF4:Yb3+，Tm3+納米探針懸液的混合液共同孵育，然后進(jìn)行上轉(zhuǎn)換成像。由于UCNPs懸液中未添加任何抗體，Jeko-1細(xì)胞表面并未釋放出藍(lán)、綠雙色UCL(見(jiàn)圖8)。

圖6 Jeko-1細(xì)胞與NaYF4:Er3+和NaYF4:Yb3+，Tm3+-CD5抗體共同孵育后上轉(zhuǎn)換成像

圖7 Jeko-1細(xì)胞與NaYF4:Er3+-CD20抗體和NaYF4:Yb3+，Tm3+共同孵育后上轉(zhuǎn)換成像

圖8 Jeko-1細(xì)胞與NaYF4:Er3+和NaYF4:Yb3+，Tm3+共同孵育后上轉(zhuǎn)換成像 (20μm)

3 討論

UCNPs在一定量的范圍內(nèi)無(wú)毒性，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)并未產(chǎn)生抑制作用，同時(shí)也不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。該粒子具有強(qiáng)大的上轉(zhuǎn)換性能，即使激光的功率非常低依然能夠高效的將低能量的近紅外光轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣芰康目梢?jiàn)光，在將來(lái)極有可能成為一種非常理想的生物探針應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)成像。通過(guò)FT-IR波譜分析，在波數(shù)2 849 cm-1和2 926 cm-1處a、b、c波譜顯示UCNPs的吸收峰強(qiáng)度逐漸降低，間接證明氧化后UCNPs與NHS、EDC成功連接以及與單克隆抗體成功偶聯(lián)。雙氧水對(duì)UCNPs表面的氧化處理以及NHS、EDC與UCNPs的成功結(jié)合為UCNPs與單克隆抗體的成功偶聯(lián)奠定基礎(chǔ)，最終UCNPs與單克隆抗體共價(jià)結(jié)合，具有靶向性的UCNPs得以被成功制備。在UCNPs偶聯(lián)有CD20和CD5單克隆抗體的情況下，UCNPs與Jeko-1細(xì)胞孵育一定時(shí)間后進(jìn)行上轉(zhuǎn)換成像，細(xì)胞表面釋放出明亮的雙色UCL，這說(shuō)明細(xì)胞表面已標(biāo)記有大量的上轉(zhuǎn)換納米粒子，CD5抗體-UCNPs軛合物和CD20抗體-UCNPs軛合物能夠和Jeko-1細(xì)胞表面相結(jié)合。而UCNPs未與某種抗體偶聯(lián)直接與Jeko-1細(xì)胞孵育，細(xì)胞表面則并未釋放出相應(yīng)的UCL，這意味著細(xì)胞與UCNPs的成功結(jié)合與UCNPs是否與相應(yīng)的抗體成功偶聯(lián)有著必然的聯(lián)系，細(xì)胞之所以被UCNPs所標(biāo)記是由于細(xì)胞表面的抗原和UCNPs上已偶聯(lián)的抗體之間發(fā)生的特異性免疫反應(yīng)所致，偶聯(lián)有相應(yīng)抗體的UCNPs能夠?qū)CL細(xì)胞株進(jìn)行靶向標(biāo)記。

目前，用于淋巴瘤細(xì)胞株靶向成像的方式主要有細(xì)胞免疫熒光技術(shù)、量子點(diǎn)靶向標(biāo)志技術(shù)、納米粒子靶向標(biāo)志技術(shù)、放射免疫示蹤法等。細(xì)胞免疫熒光技術(shù)是最為常用且較為成熟的一種細(xì)胞靶向標(biāo)志技術(shù)，同樣是根據(jù)抗原/抗體之間的特異性免疫反應(yīng)，細(xì)胞被特定的熒光素所標(biāo)志。然而，由于熒光素具有較高的光漂白性[10]，易發(fā)生熒光淬滅，因此該技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求較為苛刻，自加熒光二抗起所有的步驟必須在避光、黑暗的環(huán)境中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后需盡快在熒光顯微鏡下觀察，以防熒光淬滅影響觀察效果。量子點(diǎn)雖然已經(jīng)成功的克服以上缺點(diǎn)，但是其固有毒性和化學(xué)不穩(wěn)定性卻引起人們的廣泛關(guān)注[11]。放射免疫示蹤法也已被研究應(yīng)用于細(xì)胞的靶向標(biāo)志，其具有檢測(cè)敏感性高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便易行等優(yōu)點(diǎn)[12]，然而該方法所使用的標(biāo)志物為同位素示蹤物，該示蹤物具有一定的放射性，長(zhǎng)時(shí)間接觸會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的身體健康造成一定的輻射損傷[13]。

而UCNPs則具有獨(dú)特的光學(xué)性能，其檢測(cè)敏感性高且不具有光漂白性[14]，同時(shí)細(xì)胞對(duì)980 nm近紅外光的吸收非常低，將導(dǎo)致來(lái)自細(xì)胞的自體熒光強(qiáng)度較低，進(jìn)而增加了圖像信噪比，極大地改善了圖像的質(zhì)量[15]?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用方面，UCNPs有潛力替代傳統(tǒng)的熒光探針應(yīng)用于生物分子標(biāo)志、細(xì)胞靶向成像和動(dòng)物活體成像[16-17]。最近，有研究人員[9，18-19]已報(bào)道，上轉(zhuǎn)換納米探針在體內(nèi)和體外生物成像中的應(yīng)用進(jìn)展。在以上的生物成像研究中，經(jīng)常選擇宮頸癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、結(jié)直腸癌細(xì)胞、人口腔表皮樣癌細(xì)胞等貼壁細(xì)胞作為靶細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)且均取得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。證實(shí)在生物成像應(yīng)用中，基于上轉(zhuǎn)換納米材料的熒光探針可以被應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞的靶向生物標(biāo)志。然而關(guān)于MCL細(xì)胞株甚至其他懸浮細(xì)胞的相關(guān)報(bào)道卻并未多見(jiàn)。UCNPs在MCL細(xì)胞靶向成像中的應(yīng)用，為其將來(lái)應(yīng)用于小鼠體內(nèi)以及臨床病人體內(nèi)MCL病灶的靶向檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，CD20單克隆抗體又被稱之為美羅華，是一種高效的臨床化療藥物用于治療B細(xì)胞來(lái)源的淋巴瘤[20]。因此，UCNPs與CD20抗體的結(jié)合不僅僅有助于MCL的靶向檢測(cè)，同時(shí)對(duì)腫瘤病灶也起到精準(zhǔn)治療的效果，減少對(duì)正常細(xì)胞、組織造成不必要的損傷。受此啟發(fā)，UCNPs還具有巨大的潛力應(yīng)用于其他惡性腫瘤的早期檢測(cè)、靶向定位和精準(zhǔn)治療，對(duì)未來(lái)醫(yī)學(xué)事業(yè)的發(fā)展具有重要的指導(dǎo)意義。

綜上所述，本研究發(fā)明一種新穎的上轉(zhuǎn)換納米粒子的氧化方法，僅僅使用雙氧水對(duì)粒子表面進(jìn)行氧化。與勒米厄—馮魯?shù)侣宸蛟噭┫啾龋撗趸椒ú襟E更加簡(jiǎn)便、耗時(shí)更少。且該方法并未對(duì)納米粒子的形態(tài)大小、結(jié)構(gòu)、組成、上轉(zhuǎn)換發(fā)光性能產(chǎn)生不利的影響。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，在MCL細(xì)胞表面看到強(qiáng)烈、明亮的上轉(zhuǎn)換熒光信號(hào)。同時(shí)在980 nm近紅外光的激發(fā)下，并未看到腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的自體熒光。表面修飾功能化后的UCNPs在NHS、EDC的作用下與抗CD20/CD5抗體結(jié)合形成UCNPs-CD20/CD5抗體耦合物。UCNPs-CD20/CD5抗體耦合物作為一種高效的熒光標(biāo)志物應(yīng)用于Jeko-1細(xì)胞的免疫標(biāo)志和成像。通過(guò)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，本研究發(fā)現(xiàn)，UCNPs-CD20/CD5抗體耦合物具有靶向性，能夠?qū)CL細(xì)胞進(jìn)行特異性標(biāo)志，為以后活體內(nèi)MCL病灶的靶向檢測(cè)奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為以后對(duì)其他惡性腫瘤的早期診斷、靶向定位、精準(zhǔn)治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。