高秀飛 劉 培 葛玉清

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 浙江 杭州 310006

華佗在《中藏經(jīng)》中提出：“夫癰疽瘡腫之所作也，皆五臟六府蓄毒不流則生矣，非獨因榮衛(wèi)壅塞而發(fā)者也?！薄芭K腑蓄毒不化”可能是產(chǎn)生腫瘤的原因。由此，乳腺癌的發(fā)生是在“蓄毒”病因的長期刺激下導(dǎo)致“臟腑蓄毒不化”而致“癌毒內(nèi)生”的過程。“蓄毒”不僅可以影響臟腑氣血，導(dǎo)致臟腑失調(diào)，影響氣血津液的運(yùn)行，導(dǎo)致痰、瘀內(nèi)生。痰、瘀、毒相互影響、轉(zhuǎn)化，三者膠著，共同促進(jìn)了乳腺癌的發(fā)展。本實驗以化瘀的莪術(shù)為對照，觀察化痰的蛇六谷對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞裸鼠肺轉(zhuǎn)移的影響，為中醫(yī)藥抗乳腺癌“痰、瘀、毒”理論提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 主要試劑與儀器：RRPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清為美國GIBCO公司產(chǎn)品，CCK-8 Kit（細(xì)胞計數(shù)CCK8試劑盒）為日本DOJINDO公司產(chǎn)品、二甲基亞砜（DMSO）為SIGMA公司產(chǎn)品。潔凈工作臺（上海凈化設(shè)備廠），CO2培養(yǎng)箱（SANYO，日本）。乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇均為分析純。生物發(fā)光成像儀（XGI-8 Gas Anesthesia System）Matrigel basement membrane matrix(BD公司產(chǎn)品)，醫(yī)用顯微鏡(Nikon，日本)，血球計數(shù)板，BX60顯微鏡（Olympus，日本），Chemilmayer 5500/Spectralmayer 5000顯微彩色圖像分析系統(tǒng)（安萊生命科技有限公司）。DEPC(Sigma),TRIzol（Gibco BRL）；Super-Script反轉(zhuǎn)錄酶及其緩沖液（Gibco BRL）；Taq DNA聚合酶及其緩沖液（Roche）；dNTP(Roche)；目的基因引物及探針：Takara公司合成。

1.2 細(xì)胞：人三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所惠贈。用10%胎牛血清和10ug/ml人胰島素的RPMI1640培養(yǎng)液，在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)備用。構(gòu)建表達(dá)GFP-熒光素酶標(biāo)記的MDA-MB-231亞細(xì)胞系MDA-MB-231-GFP：取經(jīng)過五次傳代的MDAMB-231細(xì)胞，用0.125%的胰蛋白酶消化后，吹打使其分散；4℃離心1000rpm/min、5min，吸走上清，再用無菌PBS洗滌2次；用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，以每孔2×104個細(xì)胞/500μl接種24孔板，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞融合率為60%～70%且狀態(tài)良好時用于慢病毒感染。在感染前將培養(yǎng)基換成低血清的培養(yǎng)基，將已制備好的慢病毒液分別吸取200、100、50μl至3個不同的孔中，并加入polybrene，使其終濃度為10μg/ml。24小時后，換成不含polybrene的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 動物：BALB/c裸鼠70只，均為雌性，4周齡，從上海實驗動物中心/上海斯萊克實驗動物有限公司購買（生產(chǎn)許可證：SCXK滬2012-00002），飼養(yǎng)條件為SPF級。

1.4 藥物：蛇六谷由浙江省中醫(yī)院中藥房提供，產(chǎn)地臨安，批號201206；莪術(shù)由浙江省中醫(yī)院中藥房提供，產(chǎn)地廣西，批號201209：表阿霉素由輝瑞制藥（無錫）有限公司生產(chǎn)，批號H200000497；生理鹽水由上海信誼金朱藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號120701。

2 方法

2.1 建立動物模型：將MDA-MB-231-GFP細(xì)胞培養(yǎng)，待其生長狀態(tài)良好時，消化離心后計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度為2×107個/ml。無菌條件下，用4%水合氯醛按10μl/g將裸鼠常規(guī)麻醉后，以每只0.2ml尾靜脈注射建立裸鼠乳腺癌血液傳播模型。

2.2 給藥：將裸鼠隨機(jī)分為6組（A/B/C/D/E/F組），每組10只。注射細(xì)胞后3天后進(jìn)行藥物干預(yù)：A組：中藥蛇六谷水提物組；B組：蛇六谷石油醚提取物組；C組：中藥莪術(shù)水提物組；D組：莪術(shù)石油醚提取物組；E組：表阿霉素組；F組：生理鹽水組。給藥劑量按照人鼠等效劑量公式dA＝dB×(RA/RB)×（WB/WA）1/3進(jìn)行劑量換算，其中成人體重以60kg計算，裸鼠體重以20g計算。莪術(shù)和蛇六谷水提物和石油醚提取物每日灌胃：臨床劑量每日30g，人每日臨床劑量30g/60kg=0.5g/kg；小鼠每日劑量為人臨床劑量20倍，每只小鼠10g/kg×0.02=0.2g，濃度設(shè)為1g生藥/ml，0.2ml/只/天。表阿霉素每周尾靜脈注射：臨床用量每3周1次，每次60mg/m2，每周20mg/m2，每周用量為：0.5mg/kg。小鼠每日劑量為人臨床劑量10倍，每只小鼠5mg/kg×0.02=0.1mg，濃度設(shè)為0.5mg/ml，0.2ml/只/周。100mlGS+50mg的表阿霉素配置。

2.3 檢測項目：分述如下。

2.3.1 熒光生物成像：用生物發(fā)光成像儀體外觀察裸鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況，檢測裸鼠的肺是否存在轉(zhuǎn)移灶。腹腔內(nèi)注射0.2mlGFP-熒光素酶標(biāo)記的MDA-MB-231的底物，10min后放入異氟醚麻醉箱麻醉，采用生物發(fā)光成像儀（XGI-8 Gas Anesthesia System，圖1）測量（在浙江理工大學(xué)生命科學(xué)院檢測），LuminaⅡ Living Image 4.2分析。

圖1 生物發(fā)光成像儀

2.3.2 測肺重：在藥物干預(yù)后的第4周，每組脫頸處死裸鼠5只，解剖觀察有無肺轉(zhuǎn)移。取出肺等組織，用電子天平稱重。切取部分腫瘤組織0.5cm×0.5cm×0.5cm大小進(jìn)行石蠟包埋切片，部分腫瘤組織剪碎，液氮保存。計算肺轉(zhuǎn)移增重率，計算公式如下：增重率(%)=［（實驗組平均肺重-空白對照組平均肺重）/空白對照組平均肺重］×100%；在藥物干預(yù)后的第5周，實驗結(jié)束，脫頸處死所有裸鼠，解剖觀察有無肺轉(zhuǎn)移。取出肺等組織，稱重；切取部分腫瘤組織進(jìn)行石蠟包埋切片，部分腫瘤組織剪碎，液氮保存。

2.3.3 Western Blot檢測肺組織的粘附因子E-cadherin、E-selectin和趨化因子CCR7、SDF-1、CXCR4蛋白表達(dá)：提取各轉(zhuǎn)移灶組織中的蛋白質(zhì)，將組織在液氮中碾碎后，轉(zhuǎn)移至勻漿器中；在預(yù)冷的細(xì)胞裂解液中添加PMSF/異丙醇儲備液并加入到勻漿器中，冰浴條件下充分研磨后轉(zhuǎn)移至無菌1.5ml的離心管中，離心后轉(zhuǎn)移上清液至一新的1.5ml離心管中，即為組織蛋白提取液。BCA定量法測定提取液中蛋白質(zhì)濃度后即可進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。檢測各轉(zhuǎn)移灶組織中E-cadherin、E-selectin、CCR7、SLC、SDF-1、CXCR4的蛋白質(zhì)表達(dá)量。

2.3.4 Real-time PCR方法檢測肺組織的粘附因子E-cadherin、E-selectin 和趨化因子 CCR7、SLC、SDF-1、CXCR4基因表達(dá)：提取各轉(zhuǎn)移灶組織的RNA：在液氮中將組織在預(yù)冷的研缽中研碎，待研磨成粉末狀后轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器中，加入適量的Trizol，冰浴條件下輕輕充分研磨，待液體澄清后轉(zhuǎn)移至無菌1.5ml的離心管中。按照Trizol提取RNA方法，依次加入氯仿分層、異丙醇抽提RNA、75%無水乙醇洗滌后，用DEPC水溶解RNA沉淀，測定濃度及OD值。檢測各轉(zhuǎn)移灶組織中E-cadherin、E-selectin、CCR7、SLC、SDF-1、CXCR4的mRNA表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 熒光生物成像：從生物發(fā)光成像儀體外觀察裸鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況,經(jīng)尾靜脈注射MDA-MB-231-GFP細(xì)胞后各藥物干預(yù)4周后觀察到：各組模型中均可見乳腺癌肺轉(zhuǎn)移，蛇六谷水提物組、莪術(shù)石油醚提取物組能明顯抑制MDA-MB-231-GFP經(jīng)血液傳播轉(zhuǎn)移程度。見圖2。

圖2 各組藥物干預(yù)4周后的尾靜脈注射MDA-MB-231-GFP裸鼠熒光成像

經(jīng)尾靜脈注射MDA-MB-231-GFP細(xì)胞后各藥物干預(yù)5周后觀察到：蛇六谷水提物組、蛇六谷石油醚提取物組、莪術(shù)石油醚提取物組、表阿霉素組能明顯抑制MDAMB-231-GFP經(jīng)血液傳播轉(zhuǎn)移程度。見圖3。

圖3 各組藥物干預(yù)5周后的尾靜脈注射MDA-MB-231-GFP裸鼠熒光成像

3.2 測體重和肺重：采用多樣本均數(shù)間比較的單因素方差分析，方差齊性檢驗，P=0.079，提示方差齊，采用LSD法，結(jié)果顯示實驗前BALB/c裸鼠各組間體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義，排除體重對實驗結(jié)果的影響。見表1。

表1 各實驗組BALB/c裸鼠實驗前體重（±s，g）

表1 各實驗組BALB/c裸鼠實驗前體重（±s，g）

實驗前體重19.81±1.76 22.39±1.14 19.06±3.70 19.49±1.57 18.00±1.31 20.46±1.39組別蛇六谷水提物組蛇六谷石油醚提取物組中藥莪術(shù)水提物組莪術(shù)石油醚提取物組表阿霉素組生理鹽水組樣本數(shù)10 10 10 10 10 10

采用多樣本均數(shù)間比較的單因素方差分析，方差齊性檢驗，P=0.168，提示方差齊，采用LSD法，結(jié)果顯示在造模后連續(xù)給藥5周后，各組體重都降低，降低后的體重各組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。各實驗組各自治療前后量表自身對照結(jié)果，組內(nèi)配對t檢驗比較均P＞0.05，體重降低無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 各實驗組BALB/c裸鼠實驗后體重（±s，g）

表2 各實驗組BALB/c裸鼠實驗后體重（±s，g）

稱重17.80±2.86 21.48±0.51 18.60±2.46 17.72±1.44 17.84±3.18 19.90±2.27組別蛇六谷水提物組蛇六谷石油醚提取物組中藥莪術(shù)水提物組莪術(shù)石油醚提取物組表阿霉素組生理鹽水組樣本數(shù)10 10 10 10 10 10

在藥物干預(yù)后的第4周，每組脫頸處死裸鼠5只，取出肺等組織，用電子天平稱重，計算肺組織增重率，計算公式如下：增重率(%)=［（實驗組平均肺重-空白對照組平均肺重）/空白對照組平均肺重］×100%；表阿霉素肺增重不明顯，蛇六谷和莪術(shù)肺增重均明顯，其中蛇六谷石油醚提取物組肺增重最少（21%），結(jié)果如表3。

表3 各實驗組BALB/c裸鼠給藥4周肺增重率

在藥物干預(yù)后的第5周，每組脫頸處死裸鼠，取出肺等組織，用電子天平稱重，計算肺組織轉(zhuǎn)移增重率，各組的肺組織與生理鹽水組比較，均增重明顯。表阿霉素肺組織增重最低，抑制肺轉(zhuǎn)移作用最強(qiáng)；蛇六谷和莪術(shù)肺增重均明顯，其中蛇六谷石油醚提取物組肺增重最少（18%），結(jié)果如表4。

表4 各實驗組BALB/c裸鼠給藥5周肺增重率

3.3 Western Blot檢測肺組織的粘附因子E-cadherin、E-selectin和趨化因子CCR7、SDF-1、CXCR4蛋白表達(dá)：結(jié)果顯示，與生理鹽水組對比，各組藥物均降低了E-cadherin、CCR7蛋白表達(dá)；蛇六谷水提取上調(diào)E-selectin、CXCR4蛋白表達(dá)；蛇六谷石油醚和莪術(shù)石油醚提取物提取物上調(diào)SDF-1、CCL21蛋白表達(dá)，且蛇六谷石油醚作用強(qiáng)于莪術(shù)石油醚提取物（P＜0.05）。表阿霉素作用均為下調(diào)粘附因子和趨化因子的蛋白表達(dá)。見圖4、5。

圖4 各藥物對肺組織中粘附因子、趨化因子蛋白表達(dá)的影響

圖5 各藥物對肺組織中粘附因子、趨化因子蛋白表達(dá)的影響

3.4 Real-time PCR方法檢測肺組織的粘附因子E-cadherin、E-selectin 和趨化因子 CCR7、SLC、SDF-1、CXCR4基因表達(dá)：結(jié)果顯示，與生理鹽水組比較，蛇六谷水提物、蛇六谷石油醚提取物均可顯著提高細(xì)胞內(nèi)粘附因子 E-cadherin、E-selectin、CCR7 mRNA表達(dá)（P＜0.05），莪術(shù)石油醚提取物下調(diào)E-cadherin、E-selectin、CCR7 mRNA表達(dá)；蛇六谷水提物、莪術(shù)石油醚提取物提高CXCR4 mRNA的表達(dá)，且蛇六谷水提取作用強(qiáng)于莪術(shù)石油醚提取物（P＜0.05）。見圖6。

圖6 各藥物對肺組織中粘附因子、趨化因子mRNA表達(dá)的影響

4 討論

三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）在乳腺癌中約占15～20%，該類型乳腺癌所表達(dá)的雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人表皮生長因子受體2（Her-2）均為陰性，因其靶受體的喪失，三陰性乳腺癌患者不能受益于基于激素或曲妥珠單抗的靶向治療[1]。故化療仍然是該類型乳腺癌早晚期主要治療方法[2]。盡管三陰性乳腺癌患者對化療藥物如紫杉烷類和蒽環(huán)類藥物的初始反應(yīng)優(yōu)于其他乳腺癌亞型，但因其較易形成耐藥且病情進(jìn)展快速，預(yù)后仍然很差[1，3]。

中醫(yī)藥由于具有辨證論治的特點，符合腫瘤個體化治療的要求，有助于減輕放、化療的毒副反應(yīng)，可以達(dá)到抗轉(zhuǎn)移防復(fù)發(fā)、提高生活質(zhì)量、延長生存期、提高生存率的目的。近年來，中醫(yī)藥在預(yù)防乳腺癌根治術(shù)后的復(fù)發(fā)以及治療并發(fā)癥方面起到了顯著的作用。在三陰性乳腺癌治療上，中醫(yī)藥能提高患者免疫力和降低復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[4-6]。

既往研究蛇六谷和莪術(shù)均能抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞株的增殖作用[7-8]，本研究結(jié)果證實蛇六谷和莪術(shù)抗三陰性乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的作用，活血化痰解毒中藥抑制乳腺癌肺轉(zhuǎn)移，通過“以藥測證”演繹“以方測證”，提示了乳腺癌肺轉(zhuǎn)移“痰、瘀、毒”理論。其中化痰解毒的蛇六谷水提物作用較活血解毒的莪術(shù)強(qiáng)，這也同樣提示乳腺癌肺轉(zhuǎn)移痰毒最甚。蛇六谷、莪術(shù)對粘附因子和趨化因子基因和蛋白表達(dá)上不平衡，這是因為中藥成分復(fù)雜，抗腫瘤作用機(jī)理是多靶點的，對三陰性乳腺癌作用的信號特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、血管生成等方面影響諸多。蛇六谷抗腫瘤轉(zhuǎn)移的臨床和實驗研究較多[9]，針對中藥對腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的機(jī)理研究還有待于深入、細(xì)致的研究。諸類研究為今后治療三陰性乳腺癌的臨床藥物應(yīng)用提供試驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。