張 靚

（江西省九江市第一人民醫(yī)院病理科，江西 九江 332000）

本課題以人體原發(fā)性肝癌作為研究對(duì)象，以關(guān)鍵蛋白酶Caspase-3作為切入點(diǎn)，分析Caspase-3在肝癌中的表達(dá)與肝癌細(xì)胞凋亡的相關(guān)性，闡明Caspase-3在肝癌細(xì)胞凋亡中作用及其機(jī)制，為肝癌的基礎(chǔ)研究提供可靠的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本資料：選取本院2009年1月至2014年12月開(kāi)展手術(shù)切除治療的原發(fā)性肝癌（HCC）患者87例，均行組織病理學(xué)確診符合《原發(fā)性肝癌》（2013年）診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。男性65例，女性22例，年齡37～79歲，平均年齡（53.08±4.95）歲。Edmondson組織學(xué)分級(jí)：64例Ⅰ～Ⅱ級(jí)，23例Ⅲ～Ⅳ級(jí)。本次入選病例手術(shù)前均未實(shí)施免疫制劑、放療、化療。取癌組織87例（觀察組），癌旁組織58例（對(duì)照組），取肝內(nèi)膽管結(jié)石擴(kuò)張膽管旁正常肝組織21例（參考組）。

1.2 方法：全部均為術(shù)中取新鮮組織樣本，4%中性多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm厚組織切片。①Caspase-3表達(dá)：實(shí)施免疫組織化學(xué)（S-P）法檢測(cè)，選用中杉金橋（北京）生產(chǎn)的S-P（SP9001）免疫組化染色試劑盒，按流程規(guī)范操作。②細(xì)胞凋亡：實(shí)施原位末端標(biāo)記技術(shù)（TUNEL）法檢測(cè)，選用博士德生物公司生產(chǎn)的POD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（NK1020），按流程規(guī)范操作。

1.3 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：Caspase-3表達(dá)結(jié)果判定：高倍鏡（200倍）觀察，細(xì)胞質(zhì)、膜呈黃色顆粒為陽(yáng)性，①陽(yáng)性細(xì)胞著色：0分未著色，1分呈淡黃色，2分黃色，3分為棕黃色。②陽(yáng)性細(xì)胞整體比例評(píng)估，0分：陽(yáng)性細(xì)胞＜1.0%，1分：陽(yáng)性細(xì)胞1%～10%，2分：陽(yáng)性細(xì)胞11%～50%，3分：陽(yáng)性細(xì)胞51%～80%，4分：陽(yáng)性細(xì)胞＞80%。依據(jù)IRS法計(jì)算，將兩項(xiàng)評(píng)分項(xiàng)目相之和作為判定結(jié)果，陰性（-）：0分，弱陽(yáng)性（+）：1～4分，陽(yáng)性（++）：5～8分，強(qiáng)陽(yáng)性（+++）：9～12分。細(xì)胞凋亡結(jié)果判定：高倍鏡（200倍）觀察，細(xì)胞核呈黃色顆粒為陽(yáng)性，屬凋亡細(xì)胞；隨機(jī)性抽選10個(gè)高倍視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)（800個(gè)腫瘤細(xì)胞），計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI），其中AI計(jì)算方式為AI=凋亡細(xì)胞/800×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：數(shù)據(jù)納入SPSS19.0軟件分析，χ2、t檢驗(yàn)，（P＜0.05）差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組Caspase-3表達(dá)情況比較：經(jīng)檢測(cè)，觀察組肝細(xì)胞內(nèi)Caspase-3表達(dá)陽(yáng)性率39.1%（34例），對(duì)照組肝細(xì)胞內(nèi)Caspase-3表達(dá)陽(yáng)性率70.7%（41例），參考組肝細(xì)胞內(nèi)Caspase-3表達(dá)陽(yáng)性率80.9%（17例），觀察組Caspase-3表達(dá)陽(yáng)性率與對(duì)照組（參考組）均有明顯差異（P＜0.05）；對(duì)照組與參考組Caspase-3表達(dá)陽(yáng)性率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組Caspase-3表達(dá)情況比較[n（%）]

2.2 HCC肝癌Caspase-3表達(dá)與AI關(guān)系分析：將87例HCC患者按照Caspase-3表達(dá)結(jié)果進(jìn)行分組，其中Caspase-3表達(dá)陽(yáng)性組34例，Caspase-3表達(dá)陰性組53例，比較兩組細(xì)胞凋亡指數(shù)變化，結(jié)果證實(shí)，Caspase-3表達(dá)陽(yáng)性組與Caspase-3表達(dá)陰性組AI有明顯差異性（P＜0.05），二者呈負(fù)相關(guān)（-0.924，P=0.001）。見(jiàn)表2。

表2 HCC肝癌Caspase-3表達(dá)與AI關(guān)系分析（±s）

表2 HCC肝癌Caspase-3表達(dá)與AI關(guān)系分析（±s）

組別 n AI(%)Caspase-3表達(dá)陽(yáng)性組 34 5.67±3.79 Caspase-3表達(dá)陰性組 53 2.76±1.62 t 4.9418 P 0

3 討 論

Caspase-3被認(rèn)為是處于凋亡途徑的核心環(huán)節(jié)和終末效應(yīng)器酶，屬關(guān)鍵蛋白酶。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，缺乏Caspase-3小鼠表現(xiàn)為腦內(nèi)細(xì)胞過(guò)度增生和細(xì)胞發(fā)育失去有序性。為此有學(xué)者指出，Caspase依賴的細(xì)胞凋亡相關(guān)腫瘤和疾病有可能作為臨床治療腫瘤的又一新靶點(diǎn)。研究證實(shí)[2]，Caspase-3在各類腫瘤及相關(guān)細(xì)胞系內(nèi)均存在表達(dá)缺失現(xiàn)象，并與細(xì)胞凋亡抵抗現(xiàn)象及細(xì)胞對(duì)藥性耐藥抵抗有明顯關(guān)聯(lián)。如易娟等[3]檢測(cè)乳腺癌Caspase-3表達(dá)情況，認(rèn)為Caspase-3表達(dá)缺失將造成癌細(xì)胞凋亡抵抗；而白血病、宮頸癌、淋巴母細(xì)胞瘤等Caspase-3表達(dá)處于未激活狀態(tài)，將限制癌細(xì)胞對(duì)各類化療藥物所誘導(dǎo)的凋亡效果，甚至發(fā)生化療抵抗。夏鈺弘等[4]研究通過(guò)原位雜交法對(duì)HCC患者Caspase-3表達(dá)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)HCC肝細(xì)胞呈低表達(dá)，而健康肝組織細(xì)胞內(nèi)Caspase-3表達(dá)陽(yáng)性較高，由此推導(dǎo)HCC的病發(fā)可能與Caspase-3表達(dá)缺失有著關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果亦證實(shí)，HCC病灶組織內(nèi)Caspase-3表達(dá)陽(yáng)性率與癌旁組織及正常肝組織均有明顯差異；這一結(jié)果也與夏鈺弘研究相符。證實(shí)Caspase-3表達(dá)缺失可造成肝癌細(xì)胞凋亡障礙，側(cè)面反映了Caspase-3表達(dá)將誘導(dǎo)HCC癌細(xì)胞生長(zhǎng)。

細(xì)胞凋亡主要經(jīng)由基因控制的生物正常細(xì)胞自限性死亡特征，同時(shí)也是保障生物內(nèi)環(huán)境調(diào)節(jié)穩(wěn)定的機(jī)制。細(xì)胞凋亡是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，可受多種因素誘導(dǎo)所致，其中Caspase是細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)，以蛋白底物裂解、細(xì)胞解體為結(jié)局，而Caspase-3則是細(xì)胞凋亡效應(yīng)產(chǎn)生的初始執(zhí)行者，重點(diǎn)對(duì)多個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行酶切[5]。本研究比較HCC肝細(xì)胞Caspase-3表達(dá)陽(yáng)性患與陰性表達(dá)細(xì)胞凋亡指數(shù)變化，結(jié)果證實(shí)Caspase-3表達(dá)陽(yáng)性與Caspase-3表達(dá)陰性者在肝癌細(xì)胞內(nèi)AI有明顯差異性，二者呈負(fù)相關(guān)；表明Caspase-3能夠影響HCC病變，對(duì)肝細(xì)胞凋亡產(chǎn)生直接的作用。

綜上所述，Caspase-3表達(dá)缺失將造成肝癌細(xì)胞凋亡遲緩或紊亂，誘導(dǎo)HCC的病變及惡性進(jìn)展。