孫堅(jiān)萍，高夢丹，覃 嶺，代艷超，喬桂芳，張永宏

轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)是目前醫(yī)學(xué)研究中的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，而樣本資源庫作為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中的基石和重要組成部分，在疾病預(yù)防、個(gè)體化治療上發(fā)揮著越來越重要的作用[1-2]。2009年，北京市科委正式啟動(dòng)疾病資源庫項(xiàng)目建設(shè)工作。北京佑安醫(yī)院以肝炎、艾滋病等傳染病人群為主體，建立了肝炎/艾滋病傳染病樣本資源庫[3-6]。

在肝炎/艾滋病傳染病樣本資源庫中，外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)是樣本資源庫儲(chǔ)存的重要樣本。從生物樣本中提取PBMC是下游分析方法的必要前導(dǎo)環(huán)節(jié)之一。PBMC包括B細(xì)胞、T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞等，在評(píng)價(jià)免疫反應(yīng)中至關(guān)重要[7]，在疫苗研究[8-9]和臨床試驗(yàn)[10-11]中也具有重要意義。這些后續(xù)的科學(xué)研究依賴于高質(zhì)量的PBMC。本研究對(duì)樣本資源庫中肝病患者和HIV感染者這2組人群PBMC分離后細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞活力進(jìn)行了檢測分析，對(duì)從不同患者標(biāo)本中提取PBMC有一定的借鑒意義，也為潛在的樣本資源庫質(zhì)控的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程的制定提供了科學(xué)基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院2017年7月至2017年8月的標(biāo)本，標(biāo)本來源者均已簽署知情同意書。根據(jù)疾病診斷分為肝病患者(乙型肝炎)、HIV感染者和正常對(duì)照(健康體檢者)共121例，包括肝病患者35例[男18例，女17例，年齡(37.60±2.24)歲]，HIV感染者51例[男50例，女1例，年齡(33.80±1.29)歲]，對(duì)照35例[男8例，女27例，年齡(31.54±1.04)歲]。所有標(biāo)本均為當(dāng)天采集新鮮抗凝血，無手術(shù)期患者、無凝血等影響分離效果的標(biāo)本。標(biāo)本收集后立即進(jìn)行PBMC的分離。

1.2 PBMC細(xì)胞分離 采集EDTA抗凝(貨號(hào)367525，美國BD公司)外周血，F(xiàn)icoll淋巴細(xì)胞分離液(貨號(hào)AS1114546，挪威Axis-Shield公司)密度梯度離心法分離PBMC。 即將外周血離心后在距白細(xì)胞層5 mm左右停止血漿提取，使用無菌吸管向剩余標(biāo)本中加入等體積RPIM-1640(貨號(hào)SH30809.01B，美國Hyclone公司)培養(yǎng)基稀釋，顛倒混勻；使用無菌吸管或滴管將上述稀釋后血液小心的加入裝有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中(操作應(yīng)輕緩，保持血液與淋巴細(xì)胞分離液界面清晰，避免混合)。標(biāo)本置于離心機(jī)室溫離心2 200 rpm 20 min。離心完畢后棄上清液，提取PBMC于離心管中，并加入適量RPIM-1640培養(yǎng)基混合均勻，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。其余細(xì)胞離心后凍存，存儲(chǔ)于樣本資源庫中。

1.3 細(xì)胞計(jì)數(shù) 采用吖啶橙(acridineorange,AO)/碘化丙啶(propidiumiodide,PI)染液(貨號(hào)CS2-0106-5ML，美國Nexcelom公司)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，AO為浸潤性染料(膜通透性)，可侵入活細(xì)胞與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)出綠色熒光、與單鏈DNA(變性DNA)結(jié)合發(fā)出紅色熒光；PI為排斥性染料(膜不通透性)，不能進(jìn)入活細(xì)胞，與死亡或正在死亡(膜通透性改變)的細(xì)胞的核酸結(jié)合，發(fā)出紅色熒光。AO/PI雙染色可以區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞。用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Cell Counter，美國Nexcelom公司)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。即取20 μL細(xì)胞懸液，與AO/PI染料按1 ∶ 1比例混勻；取20 μL混勻液加入到細(xì)胞計(jì)數(shù)板(貨號(hào)SD100，美國Nexcelom公司)中；將加入混勻液的細(xì)胞計(jì)數(shù)板插入到自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀中，計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)、總細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和作圖均使用GraphPad Prism 6.0軟件。3組間比較采用單因素方差分析，2組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PBMC分離效果與患者年齡的相關(guān)關(guān)系 對(duì)121例樣本PBMC細(xì)胞分離后細(xì)胞濃度和患者年齡進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離后活細(xì)胞濃度與年齡相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，分離后總細(xì)胞濃度和年齡相關(guān)性也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，圖1。

A：活細(xì)胞濃度和年齡

B：總細(xì)胞濃度和年齡圖1 細(xì)胞濃度和年齡間的相關(guān)性分析

2.2 不同人群PBMC分離效果比較 對(duì)3組人群PBMC細(xì)胞分離效果進(jìn)行分析，分離后總細(xì)胞數(shù)濃度結(jié)果顯示對(duì)照組分離細(xì)胞最多(1.54×106，9.03×105～3.53×106)，其次為HIV感染者人群(1.08×106，3.72×105～2.82×106)，最后為肝病患者(8.49×105，3.61×105～2.30×106，圖2B)，3組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

分析活細(xì)胞結(jié)果顯示對(duì)照組分離后活細(xì)胞濃度最高(1.53×106，8.79×105～3.51×106)，其次為HIV感染者人群(1.06×106，3.46×105～2.77×106)，最后為肝病患者(8.44×105，3.54×105～2.25×106，圖2A)，3組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

分析分離后的細(xì)胞活性(圖2C)，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組細(xì)胞活性(98.40±0.39)高于肝病患者(97.28±0.33)和HIV感染者(96.86±0.37)，3組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 不同人群PBMC細(xì)胞分離效果比較

2.3 根據(jù)性別分組不同人群PBMC細(xì)胞分離效果比較 因?yàn)镠IV感染者中50例為男性而且年齡偏低，在上述分組時(shí)性別和年齡在組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。為排除性別和年齡的影響，根據(jù)性別進(jìn)行分組并剔除55歲以上的人群，對(duì)滿足條件的13例肝病患者，50例HIV感染者，8例對(duì)照進(jìn)行PBMC分離后活細(xì)胞濃度、總細(xì)胞濃度和細(xì)胞活性的比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在全部是男性的人群中，3組人群之間在PBMC分離方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2，圖3)。對(duì)照組在活細(xì)胞濃度和總細(xì)胞濃度方面最高，其次為HIV感染者，最后為肝病患者。而細(xì)胞活性也是對(duì)照組高于肝病患者和HIV感染者。另外，對(duì)女性人群進(jìn)行分組分析(因HIV感染者只有1例，未進(jìn)行分析)，17例肝病患者和27例正常對(duì)照之間進(jìn)行PBMC分離后活細(xì)胞濃度、總細(xì)胞濃度和細(xì)胞活性的比較，也發(fā)現(xiàn)肝病患者分離效果低于正常對(duì)照組(P<0.05，表3，圖4)。結(jié)果顯示對(duì)照組分離后活細(xì)胞濃度和總細(xì)胞濃度均高于肝病患者。細(xì)胞活性雖然正常對(duì)照組也高于肝病患者，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 3組人群基本臨床資料和PBMC分離效果比較

注：3組性別、年齡、活細(xì)胞、總細(xì)胞比較，均P<0.05

表2 55歲以下男性PBMC分離效果比較

注：3組活細(xì)胞、總細(xì)胞比較，均P<0.05

表3 55歲以下女性PBMC分離效果比較

注：2組活細(xì)胞、總細(xì)胞比較，均P<0.05

圖3 男性人群中不同分組人群PBMC細(xì)胞分離效果比較

圖4 女性人群中不同疾病人群PBMC細(xì)胞分離效果比較

3 討論

佑安醫(yī)院傳染病樣本資源庫在建庫時(shí)，對(duì)比國內(nèi)外疾病資源庫的建設(shè)狀況，借鑒和吸收國際生物和環(huán)境樣本庫協(xié)會(huì)、世界經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織以及IS0 9001-2008質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)要求進(jìn)行建庫。目前佑安醫(yī)院傳染病資源庫已成為國際生物和環(huán)境樣本庫協(xié)會(huì)會(huì)員，同時(shí)也通過了ISO9001質(zhì)量認(rèn)證。在佑安醫(yī)院傳染病樣本資源庫中，PBMC會(huì)涉及到后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)，因此，所有標(biāo)本在處理過程中，無論是否涉及傳染性疾病，均在二級(jí)生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，處理人員按照二級(jí)防護(hù)要求穿戴隔離衣、口罩、帽子、手套等。涉及傳染病的標(biāo)本其廢棄物處理按照傳染病廢棄物處理原則進(jìn)行集中消毒處理。

樣本資源庫中的樣本質(zhì)量對(duì)后續(xù)科學(xué)研究具有重要意義[12-13]。關(guān)于樣本的處理有報(bào)道在不同處理時(shí)間、不同處理溫度等條件下對(duì)血漿收集的影響，結(jié)果表明代謝產(chǎn)物與時(shí)間相關(guān)，隨著時(shí)間延長代謝產(chǎn)物會(huì)增多[14]。在PBMC分離技術(shù)方法方面，有報(bào)道為利用PBMC從而進(jìn)行下游應(yīng)用研究，可以根據(jù)研究目的選擇最佳的PBMC分離方法[15]。本研究主要對(duì)佑安醫(yī)院傳染病樣本資源庫中不同疾病人群的PBMC分離效果進(jìn)行了比較。在檢測方法上，本研究通過AO/PI染料對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙熒光染色，利用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，避免人為主觀因素影響，并可以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本快速大量的計(jì)數(shù)。以往常用細(xì)胞活性檢測方法如臺(tái)盼蘭染色，耗時(shí)耗力，且較難達(dá)到精確計(jì)數(shù)。

從送入佑安醫(yī)院傳染病樣本資源庫中的標(biāo)本中隨機(jī)選擇肝病患者、HIV感染者以及正常對(duì)照組，排除手術(shù)期患者、輸液患者、溶血凝血等影響分離PBMC的患者，標(biāo)本均為當(dāng)天新鮮采集，室溫放置。 分離PBMC都需要新鮮血液,最好不要超過24 h,佑安醫(yī)院傳染病樣本資源庫要求標(biāo)本采集后6 h內(nèi)進(jìn)行PBMC分離。首先測量采集的外周血血量，再利用密度梯度法分離PBMC，計(jì)算每毫升外周血分離出的細(xì)胞濃度。結(jié)果顯示(表1)3組人群PBMC細(xì)胞分離效果方面，對(duì)照組分離后不論是活細(xì)胞濃度還是總細(xì)胞濃度均為最高，其次為HIV感染者，最后為肝病患者。而細(xì)胞活性方面，對(duì)照組細(xì)胞活性高于肝病患者和HIV感染者。在全部為男性的分組中，也發(fā)現(xiàn)同樣的趨勢，即對(duì)照組在活細(xì)胞濃度和總細(xì)胞濃度方面最高，其次為HIV感染者，最后為肝病患者。而細(xì)胞活性也是對(duì)照組高于肝病患者和HIV感染者。在全部為女性的分組中，對(duì)照組分離后活細(xì)胞濃度和總細(xì)胞濃度均高于肝病患者，細(xì)胞活性雖然也高于肝病患者，但差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

雖然PBMC細(xì)胞來源者存在個(gè)體差異，但是盡量選擇年齡性別一致的3組進(jìn)行比較。結(jié)果提示患有肝病和HIV感染的患者在分離PBMC方面均受影響，HIV感染者因HIV病毒感染的靶細(xì)胞為T淋巴細(xì)胞[16]，分離效果受影響可從該方面解釋。肝病患者PBMC分離效果也受影響，有可能與肝病患者細(xì)胞免疫功能低下、體液免疫功能和細(xì)胞因子紊亂與亢進(jìn)，免疫不平衡等所導(dǎo)致。國內(nèi)研究顯示乙肝患者外周血細(xì)胞數(shù)量降低，存在淋巴細(xì)胞亞群失衡和細(xì)胞免疫功能紊亂[17-18]。雖然不同疾病的患者PBMC細(xì)胞數(shù)量和活力有差異，在細(xì)胞凍存時(shí)，佑安醫(yī)院傳染病樣本資源庫根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果來凍存細(xì)胞，每凍存管中需要達(dá)到5×106細(xì)胞方可進(jìn)行凍存?？傊芯拷Y(jié)果為不同人群分離PBMC細(xì)胞研究提供了科學(xué)依據(jù)，對(duì)肝病患者和HIV感染者分離PBMC時(shí)應(yīng)考慮其自身的疾病影響。