侯東敏, 王政昆, 楊 濤, 朱萬(wàn)龍

(云南省高校西南山地生態(tài)系統(tǒng)動(dòng)植物生態(tài)適應(yīng)進(jìn)化及保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 云南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 昆明 650500)

遺傳多樣性指的是生物遺傳信息的總和[1]。通常研究的是種群內(nèi)不同群體間或群體內(nèi)不同個(gè)體間的遺傳變異。遺傳多樣性的復(fù)雜程度對(duì)生物生存和發(fā)展很重要，所以就如何提高物種或者群體的遺傳多樣性具有重要的意義[2]。線粒體DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)是細(xì)胞核外的遺傳物質(zhì)，具有分子小而穩(wěn)定、母系遺傳、進(jìn)化速度快等特點(diǎn)，進(jìn)化速率遠(yuǎn)高于單拷貝核基因，適合用于群體遺傳學(xué)分析的分子標(biāo)記[3]。其中細(xì)胞色素b基因(Cytb)經(jīng)常用于進(jìn)化生物學(xué)、保護(hù)生物學(xué)、遺傳多樣性等方面，是適用性很強(qiáng)的分子標(biāo)記[4-6]。

中緬樹(shù)鼩(Tupaiabelangeri)隸屬于攀鼩目(Sandentia)樹(shù)鼩科(Tupaiidae)，是一類外形類似松鼠的小型哺乳動(dòng)物物[7-8]。廣泛分布于南亞、東南亞，在我國(guó)主要分布于云南、貴州、廣西、四川及海南等地。大量研究表明，樹(shù)鼩的進(jìn)化地位和靈長(zhǎng)類很接近，比嚙齒類動(dòng)物更接近于人類。再加上其易飼養(yǎng)、成本低、繁殖快和體型小易控制等原因被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)各個(gè)分支學(xué)科[9-10]。如今，隨著國(guó)內(nèi)外靈長(zhǎng)類動(dòng)物資源的匱乏以及模式動(dòng)物小型化，樹(shù)鼩已成為具有極大潛在價(jià)值的新型模式動(dòng)物，受到越來(lái)越多的科研工作者的關(guān)注[11-12]。本實(shí)驗(yàn)利用Cytb基因探討11個(gè)地理種群中緬樹(shù)鼩的遺傳多樣性，為中緬樹(shù)鼩成為新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型提供一定的遺傳基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理

本實(shí)驗(yàn)所采用的實(shí)驗(yàn)樣本來(lái)源于廣西壯族自治區(qū)、四川省、貴州省、海南省以及云南省共計(jì)11個(gè)代表性地點(diǎn)，采集樣本總數(shù)為124個(gè)。具體采集信息見(jiàn)表1。

表1 中緬樹(shù)鼩采樣點(diǎn)基本信息

1.2 DNA的提取

用E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit試劑盒提取總DNA。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提DNA 的純度，將完整性較強(qiáng)的DNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物及反應(yīng)體系

Cytb基因的引物來(lái)源參照本實(shí)驗(yàn)室之前的研究[4]，引物序列(14071F：5′-GGATCTGACCAAGACCTGTGAC-3′；15320R：5′-TCCCTCCGTTTCTGGTTTAC-3′)。產(chǎn)物覆蓋長(zhǎng)度為1300 bp。PCR反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，58.0℃退火10 s，72℃延伸10 s，72℃再延伸5 min，總共30個(gè)循環(huán)數(shù)。PCR產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在AlphaImager@ Mini凝膠成像儀上觀察。將純度較高的樣品保存在-4℃冰盒中送至昆明碩擎生物有限責(zé)任公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

用Seqman軟件查看Cytb基因的峰圖。獲得的序列用MEGA 5.05軟件進(jìn)行全序列的比對(duì)；并計(jì)算其遺傳距離，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)；用DnaSP軟件計(jì)算單倍型數(shù)(H)、單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(π)、變異位點(diǎn)(Vs)等分析堿基序列的遺傳多樣性；并計(jì)算各種群間的基因流(Nm)、分化指數(shù)(Fst)、平均核苷酸差異(Dxy)和凈遺傳距離(Da)探討各種群間的分化程度；通過(guò)DnaSP軟件計(jì)算各個(gè)地理種群的Tajima′s D和Fu′s Fs statistic檢驗(yàn)、錯(cuò)配分布圖，檢測(cè)中緬樹(shù)鼩在歷史進(jìn)程中有沒(méi)有接受種群擴(kuò)張。用Arlequin3.0軟件計(jì)算種群間的分子變異分析。線粒體Cytb總體序列的進(jìn)化樹(shù)是先由MEGA軟件基于Kimura雙參數(shù)法計(jì)算出遺傳距離，然后利用鄰接法(Neighbor-joining)，使用最大組成似然模型(Maximum Composite Likelihood，MCL)，檢測(cè)數(shù)為1000次，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。進(jìn)化樹(shù)上的每一小枝代表一個(gè)樣本，節(jié)點(diǎn)處的數(shù)值NJ分析獲得的支持率，枝長(zhǎng)代表分歧度。

2 結(jié)果

2.1 線粒體Cyt b基因堿基組成分析

通過(guò)分析中緬樹(shù)鼩線粒體Cytb基因測(cè)序結(jié)果，序列片段總長(zhǎng)度為1073 bp，A、T、G、C比例分別為26.9%、28.9%、29.1%和15.1%，A+T(55.8%)的比例高于C+G(44.2%)。

2.2 線粒體Cyt b基因堿基多樣性分析

表2中顯示出了中緬樹(shù)鼩124個(gè)樣本的Cytb基因堿基的變異位點(diǎn)和遺傳多樣性，其中樣本總體的單倍型個(gè)數(shù)為66個(gè)，變異位點(diǎn)數(shù)為262個(gè)，單倍型多樣性為0.981，平均核苷酸變異數(shù)為51.789，核苷酸多樣性為0.051 70。各個(gè)種群中，騰沖種群的單倍型和核苷酸多樣性最高，西昌種群的單倍型多樣性最高。

2.3 線粒體Cyt b基因單倍型分布

由DnaSP軟件確定了66個(gè)單倍型，占總樣本量的53.66%。其中有58個(gè)單倍型是各個(gè)種群所特有類型，占所有種群的87.9%；有8個(gè)共享單倍型(H4、H9、H27、H30、H34、H36、H38及H54)。具體各單倍型的分布詳見(jiàn)表3。

表2 不同種群Cyt b基因序列的變異位點(diǎn)和遺傳多樣性

2.4 線粒體Cyt b基因進(jìn)化樹(shù)分析

由圖1看出進(jìn)化樹(shù)分出的4大支可信度很強(qiáng)，這4支分別是大新種群一支、海南種群一支、片馬和騰沖種群一支，其余種群聚為一支。說(shuō)明中緬樹(shù)鼩種群出現(xiàn)了一定的種群分化。

表3 中緬樹(shù)鼩Cyt b基因采樣點(diǎn)及單倍型信息

2.5 線粒體Cyt b基因AMOVA分析

由表4可知，種群間的方差占總變異的75.12%，種群內(nèi)的方差占總變異的24.88%，表明變異主要發(fā)生在種群間。且Fst的值大于0.25小于1(Fst=0.75119)，表明不同樹(shù)鼩種群間已出現(xiàn)高度的遺傳分化。

2.6 線粒體Cyt b基因的遺傳距離

通過(guò)計(jì)算各種群間的基因流(Nm)、分化指數(shù)(Fst)、平均核苷酸差異(Dxy)和凈遺傳距離(Da)探討各種群間的分化程度。表5中，中緬樹(shù)鼩11個(gè)地理種群間的基因流均小于1。說(shuō)明各地理種群間的存在的基因交流非常弱，種群間可能發(fā)生了一定的種群分化。在遺傳距離當(dāng)中，海南種群明顯高于其他種群；大新、海南及其他種群的核苷酸分歧度較大；大新種群和其他種群的凈遺傳距離較大。

圖1 線粒體Cyt b基因基于鄰接法構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)

變異來(lái)源Source of variation自由度Degree of freedom平方和Sum of squares方差組分Variancecomponents變異百分率Percentage of variationFst種群間Inter-populations102703.70023.609 93Va75.12種群內(nèi)Iutra-populations112875.8367.819 97Vb24.88總變異Total variation1223579.53731.429 890.751 19

Va表示種群間方差組分；Vb表示種群內(nèi)方差組分

表5 中緬樹(shù)鼩11個(gè)種群的擴(kuò)張檢測(cè)

2.7 線粒體Cyt b基因的擴(kuò)張性檢測(cè)

從表5中可以看出只有樂(lè)業(yè)種群的Tajima′s D的P值小于0.05且差異顯著，錯(cuò)配分布曲線呈不規(guī)則多峰型，說(shuō)明中緬樹(shù)鼩總體沒(méi)有接受種群擴(kuò)張。

3 討論與結(jié)論

堿基組成偏向性是指一個(gè)基因組的DNA序列上4種堿基不均一的分布，個(gè)別堿基出現(xiàn)不同程度富集或是偏低的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象是由突變、自然選擇、隨機(jī)遺傳漂變、基因組結(jié)構(gòu)等多種因素相互作用的結(jié)果[13-14]，可以反映出特定基因組在結(jié)構(gòu)和進(jìn)化方面的總體特征[15-16]。本實(shí)驗(yàn)基于線粒體細(xì)胞色素b基因1073 bp的序列分析了中緬樹(shù)鼩11個(gè)地理種群，表明A+T含量高于C+G含量，說(shuō)明在Cytb基因中堿基比例出現(xiàn)一定程度上的堿基組成偏向性。

Cytb基因總序列中共發(fā)現(xiàn)單倍型個(gè)數(shù)為66個(gè)，說(shuō)明中緬樹(shù)鼩具有較高的遺傳多樣性。群體中mtDNA核苷酸多樣性是衡量群體多態(tài)程度的重要指標(biāo)，值越大，群體多樣性程度越高[17-20]。本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到中緬樹(shù)鼩的核苷酸多樣性為0.051 70。相對(duì)較高H值和較低π值表明中緬樹(shù)鼩這個(gè)種群可能是由一個(gè)較小的有效種群經(jīng)歷瓶頸效應(yīng)或建群者效應(yīng)后迅速增長(zhǎng)，導(dǎo)致單倍型因變異使得多態(tài)性積累，但核苷酸序列的多樣化還未能積累[21-25]。核苷酸多樣性最高的是騰沖種群，為0.061 44，最低的是昆明種群，為0.002 97，說(shuō)明騰沖種群具有較高的遺傳多樣性。單倍型多樣性的值同樣可以用來(lái)判斷一個(gè)種群的多態(tài)性，本實(shí)驗(yàn)中各個(gè)種群?jiǎn)伪缎投鄻有缘娜≈捣秶鸀?.553～0.948，最高值和最低值的分別是西昌種群和樂(lè)業(yè)種群。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到11個(gè)地理種群的變異位點(diǎn)數(shù)為262個(gè)，并通過(guò)AMOVA分析發(fā)現(xiàn)，變異主要發(fā)生在種群間，且已經(jīng)出現(xiàn)較高的遺傳分化。進(jìn)一步對(duì)中緬樹(shù)鼩總序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，11個(gè)地理種群分為4大支，且可信度達(dá)到99，大致可以把11個(gè)地理種群分為海南種群、大新種群、騰沖片馬種群和其他種群。

中性檢測(cè)和擴(kuò)張檢測(cè)可以用來(lái)判斷種群經(jīng)歷的歷史事件[26-28]。中性檢驗(yàn)中Tajima′s D值是否顯著來(lái)推測(cè)種群在過(guò)去是否發(fā)生過(guò)擴(kuò)張，通過(guò)考察各個(gè)種群的核苷酸不匹配曲線是否呈單峰型或多峰型，也可以檢測(cè)種群是否發(fā)生過(guò)擴(kuò)張。從表5可以看出中緬樹(shù)鼩總體樣本的Tajima′s D和Fu′s Fs statistic檢驗(yàn)結(jié)果都不顯著，表明中緬樹(shù)鼩未經(jīng)歷種群擴(kuò)張。

綜上所述，中緬樹(shù)鼩11個(gè)地理種群具有較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性，表明中緬樹(shù)鼩可能經(jīng)歷過(guò)瓶頸效應(yīng)或建群者效應(yīng)。種群變異分析表明11個(gè)地理種群可能已經(jīng)出現(xiàn)分化，大致分為4個(gè)類群：海南種群、大新種群、騰沖片馬種群和其他種群。