孟曉智，蘇貴森，卓品利, 2，王 超，張 帥，倪嘉豪，徐年軍, 2 ，李亞鶴, 2

(1. 寧波大學(xué) 海洋學(xué)院， 寧波 315211； 2. 浙江省海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 寧波 315211)

自2007年以來，中國沿海爆發(fā)了大規(guī)模的滸苔綠潮，且呈現(xiàn)出常態(tài)化、連續(xù)性的爆發(fā)趨勢，這在一定程度上破壞了當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)系統(tǒng)，給水產(chǎn)養(yǎng)殖、旅游及居民生活等帶來了一定的負(fù)面影響[1]。國內(nèi)外學(xué)者從多個方面對滸苔綠潮進(jìn)行了相關(guān)研究，包括滸苔的生活史、繁殖方式、爆發(fā)源頭及機(jī)制、種質(zhì)鑒定及光合生理等[2-6]。普遍認(rèn)為，滸苔是一種廣溫、廣鹽性海藻，繁殖方式復(fù)雜多樣[7]，具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力[8]。初步認(rèn)定滸苔綠潮的爆發(fā)機(jī)制多為海洋環(huán)境要素(溫度、光照強(qiáng)度、鹽度等)的變化、快速增值能力及海水富營養(yǎng)化等[9]，但已有的研究多限于其最適環(huán)境條件的摸索。

湯文仲等[10]運(yùn)用葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)探討了溫度、光照強(qiáng)度對緣管滸苔(Ulvalinza)光合作用的影響。結(jié)果表明，緣管滸苔的最適溫度為25℃，最適光照強(qiáng)度為72 μmol/m2·s，但海藻間的種間差異也是存在的，相比于緣管滸苔，滸苔對溫度、鹽度變化具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力[11-12]。此外，滸苔生長過程中形態(tài)學(xué)變化也受溫度、鹽度的影響[13]，溫度、鹽度的升高抑制了滸苔側(cè)枝的生成，但促進(jìn)了單個側(cè)枝的生長，且溫度、鹽度具有顯著的交互效應(yīng)[14]。韓紅賓等[15]首次系統(tǒng)地探討了溫度、光照強(qiáng)度分別對滸苔孢子/配子的放散和萌發(fā)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，滸苔孢子/配子的放散和萌發(fā)具有不同的適宜溫度和光照強(qiáng)度的能力，即滸苔生活史的不同階段對溫度、光照強(qiáng)度的響應(yīng)不同，那么，二者對滸苔幼苗的光合生理有怎樣的復(fù)合效應(yīng)，需進(jìn)一步研究。另外，在江浙一帶，滸苔基于其較高的營養(yǎng)價值被廣泛食用，如滸苔多糖具有降血脂作用[16]，是一種具有開發(fā)前景的海洋食品。本文以滸苔幼苗(約長8～10 cm)為材料，設(shè)置3個溫度梯度和2個光照強(qiáng)度，研究溫度和光照強(qiáng)度對滸苔幼苗生長、光合生理的復(fù)合效應(yīng)，一方面為研究滸苔綠潮的爆發(fā)提供基礎(chǔ)資料；另一方面也為滸苔的規(guī)?；B(yǎng)殖提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

藻種滸苔(U.prolifera)由浙江象山旭文海藻開發(fā)有限公司提供，保種在光照培養(yǎng)箱(GXZ，寧波江南儀器廠)中，保種的條件為：溫度15℃；光照強(qiáng)度30～40 μmol/m2·s。培養(yǎng)基采用f/2加富[17]的滅菌人工海水(海水鹽度調(diào)至25°)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個溫度梯度(20℃、25℃和30℃)和2個光照強(qiáng)度[250 μmol/m2·s(預(yù)實(shí)驗(yàn)測定其光合放氧-光照強(qiáng)度響應(yīng)曲線，顯示該光強(qiáng)接近其飽和光強(qiáng)，標(biāo)記為高光)、70 μmol/m2·s(預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示，該光強(qiáng)在光補(bǔ)償點(diǎn)之上)]。起始鮮重約為0.1 g的滸苔培養(yǎng)在6個不同處理(低溫低光：20℃+70 μmol/m2·s；中溫低光：25℃+70 μmol/m2·s；高溫低光：30℃+70 μmol/m2·s；低溫高光：20℃+250 μmol/m2·s；中溫高光：25℃+250 μmol/m2·s；高溫高光：30℃+250 μmol/m2·s)下，每天測定鮮重，每兩天更換一次培養(yǎng)基(培養(yǎng)基同上)，生長速率穩(wěn)定后進(jìn)行葉綠素?zé)晒庑省岛粑肮夂戏叛跄芰Φ臏y定。

1.3 生長速率的測定

在每天的同一時間(約13: 00)進(jìn)行滸苔鮮重的測定，具體操作如下：用長鑷子將滸苔取出，用吸水紙吸干藻體表面的水分(為減少操作誤差，該工作由同一個人操作)，稱鮮重。相對生長速率(RGR；%/day)=Ln(Wn/Wn-1)/(tn-tn-1)× 100，Wn-1、Wn分別為tn-1、tn時的藻體鮮重。

1.4 葉綠素的提取及測定

取一定重量的藻體放入15 mL離心管中，加入5 mL甲醇，放置于4℃冰箱中，過夜提取后用紫外分光光度計(jì)(UV6100A，上海元析儀器有限公司)進(jìn)行全波段掃描(280～750 nm)。而后根據(jù)公式Chl a=15.65A666-7.34A653計(jì)算葉綠素a(Chl a)的含量[18]。

1.5 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定

通過葉綠素調(diào)制熒光儀(water PAM)測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)。1)最大(Fv/Fm)及培養(yǎng)光強(qiáng)下的有效光化學(xué)效率(Fv′/Fm′)：不同處理的樣品在黑暗條件下處理15 min，在培養(yǎng)光強(qiáng)下(光化光接近培養(yǎng)光強(qiáng))測定葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線，獲得Fv/Fm及Fv′/Fm′。2)快速光響應(yīng)曲線(P-E curve)的測定：設(shè)置8個光強(qiáng)梯度(114、167、257、379、570、861、1218及1692 μmol/m2·s)，每個光強(qiáng)梯度持續(xù)時間為10 s，飽和脈沖為5000 μmol/m2·s。并根據(jù)rETR=E/(aE2+bE+c)進(jìn)行曲線擬合，其中，rETR為相對電子傳遞速率，E為光化光強(qiáng)度。根據(jù)擬合參數(shù)計(jì)算最大相對電子傳遞速率(rETRmax)、表觀光能利用效率(α)及飽和光強(qiáng)(Ek)，計(jì)算公式如下：rETRmax=1/(b+2(a×c)1/2);α=1/c;Ek=rETRmax/α[19]。

1.6 暗呼吸和光合放氧能力的測定

采用液相氧電極(Hansatech，英國)進(jìn)行暗呼吸和光合放氧能力的測定。取一定鮮重的滸苔(約0.015 g)置于反應(yīng)槽中(含2 mL預(yù)先在培養(yǎng)溫度下充氣的新鮮培養(yǎng)基)，由恒溫水槽控制溫度。黑暗條件下反應(yīng)槽內(nèi)O2濃度的變化速率即為暗呼吸的速率(Rd)，采用LED燈提供外源光強(qiáng)，通過調(diào)控LED燈和反應(yīng)槽的距離獲得各自培養(yǎng)光強(qiáng)下的凈光合放氧速率(Pn)，并計(jì)算總光合放氧速率(Pg；Pg=Rd+Pn)及Rd與Pg的比值(Rd/Pg)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用Origin 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖，使用SPSS18.0進(jìn)行顯著性分析，顯著水平設(shè)置為P< 0.05，顯著性通過在圖中或者表格中標(biāo)注不同的小寫字母來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理下的生長和葉綠素含量

相比于低光處理，高光顯著促進(jìn)了滸苔的生長，在溫度20℃、25℃及30℃條件下，增幅分別高達(dá)70%、120%及130%。溫度從20℃升高至25℃對滸苔生長、葉綠素含量的影響不顯著，但升高至30℃抑制其生長(圖1-A)，提高Chl a的含量，尤其是低光培養(yǎng)時，和20℃相比，Chl a含量的增幅高達(dá)100%(圖1-B)。

2.2 不同處理下的光化學(xué)參數(shù)

整體來說，本實(shí)驗(yàn)所選的溫度、光照水平對滸苔最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)的影響不顯著，各個培養(yǎng)條件下的Fv/Fm基本維持在0.7～0.8之間(圖2-A)。同時，不同處理的有效光化學(xué)效率(Fv′/Fm′)基本維持在0.51～0.56之間，但在培養(yǎng)溫度為高溫30℃和光照條件為高光時，滸苔的Fv′/Fm′顯著降低，相比于低光處理，降幅約為28%(圖2-B)。

隨著光強(qiáng)的增加，滸苔的相對電子傳遞速率逐漸增加，而后趨于平穩(wěn)(圖3)，其光能利用效率(α)在不同處理間差異不顯著。但高光條件下，低溫(20℃、25℃)培養(yǎng)的滸苔具有較高的最大相對電子速率(rETRmax)，而在30℃時，該值顯著降低。低光條件下，溫度對滸苔的rETRmax、α及飽和光強(qiáng)(Ek)的影響不顯著(表1)。

表1 滸苔在不同處理下的光合作用速率(rETR)與光強(qiáng)關(guān)系的最佳擬合參數(shù)

rETRmax：最大相對電子傳遞速率；α：表觀光能利用效率；Ek：飽和光強(qiáng)(n=3)。不同字母表示不同處理間差異顯著(P< 0.05)

圖1 不同處理下滸苔的相對生長速率(A)和葉綠素a(Chl a)的含量(B，n=3)

不同字母表示不同處理間差異顯著(P< 0.05)；下同

圖2 不同處理下滸苔的最大(Fv/Fm；A)及有效光化學(xué)效率(Fv′/Fm′；B)

圖3 不同處理下滸苔的相對電子傳遞速率

2.3 不同處理下的暗呼吸和光合放氧能力

相比于低光處理，光照強(qiáng)度的增加提高了滸苔的暗呼吸能力，尤其是在溫度25℃、30℃條件下，增幅分別約為60%和80%。同時，相比于20℃，其暗呼吸速率在25℃、30℃條件下也被顯著提高，尤其是在25℃、高光條件下(圖4-A)。

圖4 不同處理下滸苔的暗呼吸(A)、凈光合放氧速率(B)及呼吸與總光合放氧速率比值(C)

低光條件下，溫度變化對滸苔的凈光合放氧速率影響不顯著，但在高光條件下，該值在25℃時最高，而20℃、30℃均抑制滸苔的光合放氧速率(圖4-B)。通過計(jì)算獲得不同培養(yǎng)條件下滸苔暗呼吸和總光合放氧速率的比值，發(fā)現(xiàn)該比值在高光低溫條件下最低，但隨著溫度的增加，光照強(qiáng)度對其影響逐漸降低(圖4-C)。

3 討論

滸苔具有復(fù)雜的繁殖方式和較強(qiáng)的環(huán)境耐受能力，對溫度、鹽度和光照強(qiáng)度等都有廣泛的適應(yīng)性[8]。有研究表明，在營養(yǎng)鹽充足的前提下，適宜的溫度和鹽度是誘導(dǎo)滸苔爆發(fā)的關(guān)鍵因素[20]。光照是海藻光合作用的能量來源，光照強(qiáng)度的大小在一定程度上決定著海藻光合作用的強(qiáng)弱和生長的快慢。有研究表明滸苔(U.prolifera)的最適光照強(qiáng)度為100～120 μmoL/m2·s[8, 21]，緣管滸苔(U.linza)的最適光照強(qiáng)度為72 μmoL/m2·s[10]，但本研究的結(jié)果顯示，在3個溫度條件下，相比于低光70 μmoL/m2·s，高光250 μmoL/m2·s顯著促進(jìn)了滸苔的生長(圖1-A)。吳洪喜等[8]的研究中采用了連續(xù)光照模式，本研究采用的是光暗比為12:12，從這個角度來說，二者的研究結(jié)果相似，但顯著高于緣管滸苔的最適光照強(qiáng)度(72 μmoL/m2·s)，這一方面體現(xiàn)了種間差異，另一方面可能與培養(yǎng)溫度和鹽度有關(guān)。在緣管滸苔的研究中[10]，溫度、光照強(qiáng)度分別為單因子試驗(yàn)，且在光照強(qiáng)度單因子試驗(yàn)中沒有指出培養(yǎng)溫度、鹽度，但其前期的培養(yǎng)溫度為15℃，而本實(shí)驗(yàn)所設(shè)置的3個溫度均高于15℃。劉榆莎等[22]的研究顯示，滸苔生長對光照強(qiáng)度的響應(yīng)受鹽度的調(diào)節(jié)。滸苔的生長具有低輻照適應(yīng)性，高光強(qiáng)促進(jìn)滸苔孢子的釋放[23]。韓紅賓等[15]的研究也顯示，在60～240 μmoL/m2·s的范圍內(nèi)，孢子/配子的放散與光照強(qiáng)度成正比，并在300 μmoL/m2·s達(dá)到最大值，其萌發(fā)的最適光照強(qiáng)度為120 μmoL/m2·s，結(jié)合本研究的結(jié)果，即滸苔幼苗在高光250 μmoL/m2·s條件下的生長速率遠(yuǎn)高于低光70 μmoL/m2·s，可以推測生活史不同階段的滸苔藻體對光照強(qiáng)度的要求及適應(yīng)能力不同，這在一定程度上與滸苔綠潮爆發(fā)的區(qū)域性、時間性及連續(xù)性密切相關(guān)。同時，滸苔綠潮爆發(fā)時，生活在綠潮表層的藻體(接受強(qiáng)的光照強(qiáng)度)通過熱耗散或能量的重新分配，以及降低葉綠素含量等避免高光強(qiáng)對光系統(tǒng)的損傷，而生活在綠潮底層的藻體(接受較低的光照強(qiáng)度)則通過增加葉綠素含量及改變Chl a與Chl b的比值來提高光能利用效率[24]，這與本文的結(jié)果一致，即高光條件下滸苔具有較低含量的Chl a(圖1-B)，也在一定程度上顯示出滸苔較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力[8]。

溫度是影響海藻生長的另一重要因素，滸苔綠潮在不同沿海地區(qū)爆發(fā)的時間不同，一般來說，山東青島的滸苔綠潮基本在夏季爆發(fā)，而浙江寧波滸苔在每年的1、2月份大規(guī)模生長，這與當(dāng)?shù)睾Ｓ蚝Ｋ疁囟扔忻芮械年P(guān)系，滸苔綠潮爆發(fā)的最適溫度是20℃～25℃[25]，這與本文的結(jié)果相似，即實(shí)驗(yàn)所設(shè)置的兩個光照強(qiáng)度下，滸苔在20℃、25℃具有較高的生長速率(圖1-A)。湯文仲等[10]的研究顯示，溫度和光照強(qiáng)度對緣管滸苔最大相對電子傳遞速率的影響具有顯著的交互作用，該現(xiàn)象與本研究的結(jié)果相似，即高光、高溫顯著降低了滸苔的Fv′/Fm′(圖3-B)和rETRmax(圖4、表1)，但在低光條件下，溫度的效應(yīng)不顯著，主要是因?yàn)楦吖鈼l件下，光照強(qiáng)度和溫度的升高在一定程度上破壞了滸苔光系統(tǒng)Ⅱ的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其失活，進(jìn)而抑制該條件下滸苔的生長(圖1)。Gao等[14]的研究表明，培養(yǎng)在20℃和25℃環(huán)境中的滸苔具有相似的相對生長速率，這與本研究的結(jié)果相似(圖1-A)，但溫度的變化影響滸苔分枝的數(shù)量及長度，具體表現(xiàn)為溫度從20℃升高到25℃，滸苔分枝的數(shù)量增加，但其長度降低，即溫度變化影響滸苔的形態(tài)，而本實(shí)驗(yàn)是溫度的短期實(shí)驗(yàn)，沒有觀測到不同溫度下滸苔的形態(tài)變化。

整體來說，溫度、光照強(qiáng)度共同影響滸苔的生長，并具有顯著的種間差異，且生活史的不同階段對二者的敏感性不同，但本實(shí)驗(yàn)是室內(nèi)短期實(shí)驗(yàn)，在自然界中溫度、光照強(qiáng)度等環(huán)境因子的變化多樣，它們對滸苔綠潮的爆發(fā)又起到怎樣的作用，還需進(jìn)一步深入的探討。