董小林，趙 敏，陳家林，劉家壽，錢雪橋

( 1.廣東海大集團(tuán)股份有限公司 畜牧水產(chǎn)研究中心, 農(nóng)業(yè)部養(yǎng)殖用微生態(tài)資源與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 511400;2.中國科學(xué)院 水生生物研究所, 湖北 武漢 430072) )

1 對(duì)蝦養(yǎng)殖病害現(xiàn)狀及措施

1.1 對(duì)蝦養(yǎng)殖的病害威脅

我國養(yǎng)殖產(chǎn)量較多、經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的對(duì)蝦有凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)、日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeusjaponicas)、中國明對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)、長毛明對(duì)蝦(F.penicillatus)、墨吉明對(duì)蝦(F.merguienrsis)等[1]。但是目前養(yǎng)殖病害已經(jīng)成為制約對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要障礙，其中細(xì)菌性疾病是最主要的對(duì)蝦疾病之一，尤其弧菌病是當(dāng)前造成蝦苗死亡的重要原因[2]。大量應(yīng)用抗生素和消毒劑控制疾病會(huì)造成藥物殘留、細(xì)菌耐藥性轉(zhuǎn)移、生物抵抗力下降等嚴(yán)重后果[1,3]，歐洲許多國家已經(jīng)明令禁止或限制抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中的使用。相關(guān)法律法規(guī)和養(yǎng)殖環(huán)境的雙重壓力會(huì)使得抗生素或治療型化學(xué)藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)上的應(yīng)用越來越少，開發(fā)無藥殘、抗菌譜廣、安全性高的免疫增強(qiáng)劑是當(dāng)前對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)關(guān)注的重點(diǎn)。

1.2 對(duì)蝦的免疫系統(tǒng)及免疫強(qiáng)化措施

對(duì)蝦的免疫系統(tǒng)主要包括免疫器官(甲殼、鰓、血竇、淋巴器官)、免疫細(xì)胞(血細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)和各種免疫因子(免疫相關(guān)的多肽和蛋白)[4]。對(duì)蝦屬低等無脊椎動(dòng)物，主要依靠非特異性免疫系統(tǒng)來抵御感染，包括細(xì)胞免疫系統(tǒng)和體液免疫系統(tǒng)。其中血淋巴細(xì)胞在其免疫防御中起主導(dǎo)作用，細(xì)胞通過黏附作用、吞噬作用、趨化作用、包裹作用等過程直接參與免疫反應(yīng)。體液免疫系統(tǒng)包括酚氧化酶系統(tǒng)、溶菌酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶。此外，凝集素、抗菌素、抗菌肽、活性氧等免疫因子也參與免疫反應(yīng)。細(xì)胞免疫和體液免疫作用緊密相關(guān)，血細(xì)胞可合成并釋放體液免疫因子，細(xì)胞免疫反應(yīng)又受到體液免疫因子的介導(dǎo)和影響[5]。

一般使用一些免疫刺激劑來預(yù)防疾病。這類物質(zhì)分為三類：營養(yǎng)物質(zhì)的間接作用、特異性作用的疫苗、非特異性的免疫增強(qiáng)劑[1]。接種疫苗是目前漁業(yè)生產(chǎn)上預(yù)防傳染性疾病最為有效的辦法，但是對(duì)于特異性免疫系統(tǒng)不夠發(fā)達(dá)或缺乏的蝦類作用非常有限；而一些源自微生物細(xì)胞壁成分的免疫增強(qiáng)劑等有很強(qiáng)的劑量依賴性而難以把握。微生態(tài)制劑可以通過刺激非特異性免疫系統(tǒng)來提高動(dòng)物的免疫力和對(duì)傳染性疾病的抵抗力，這種免疫沒有記憶且持續(xù)時(shí)間較短，比抗生素更安全，比疫苗作用更廣泛。應(yīng)用益生菌防治對(duì)蝦疾病很有應(yīng)用前途，相關(guān)研究已取得了顯著成績。

2 微生態(tài)制劑在對(duì)蝦病害防控中的研究進(jìn)展

2.1 對(duì)蝦腸道菌群組成的研究是開發(fā)益生菌的基礎(chǔ)

對(duì)蝦腸道微生物多樣性的研究是開發(fā)應(yīng)用微生態(tài)制劑的基礎(chǔ)。陸地養(yǎng)殖動(dòng)物的常駐菌群則主要是革蘭氏陽性的專性或兼性厭氧菌，如乳酸菌和鏈球菌等；而水產(chǎn)動(dòng)物消化道的常駐菌群主要為革蘭氏陰性的兼性厭氧菌，如甲殼類的常駐菌群是弧菌和假單孢菌。因?yàn)樾笄菥鶠楹銣貏?dòng)物，其消化道界面的溫度、pH、氧化還原電位和滲透壓等均相對(duì)較為穩(wěn)定，而水產(chǎn)動(dòng)物是變溫動(dòng)物, 在攝食和運(yùn)動(dòng)過程中，其消化道內(nèi)外的微生物區(qū)系會(huì)不斷受到水流的驅(qū)動(dòng)[3]。這種生理上的差異就決定了水產(chǎn)動(dòng)物消化道內(nèi)的微生物區(qū)系穩(wěn)定性不比人或畜禽，且隨著水產(chǎn)動(dòng)物的發(fā)育、季節(jié)的更替和環(huán)境的變化而發(fā)生顯著變化。

早期主要采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)法研究對(duì)蝦腸道微生物，近年來分子方法開始被大多數(shù)人采用。普遍認(rèn)為，水生無脊椎動(dòng)物腸道微生物主要有弧菌(Vibrio)、假單胞菌(Pseudomona)、氣單胞菌(Aeromonas)、黃桿菌(Flavobacterium)和微球菌(Micrococcus)。早在20世紀(jì)80年代，Yasuda等[6]就分析了日本囊對(duì)蝦不同發(fā)育階段腸道菌群的組成，結(jié)果表明，溞狀幼體階段腸道菌群的優(yōu)勢菌群為弧菌屬；成蝦階段為假單胞菌屬；成長較差的成蝦其腸道中有大量的氣單胞菌和弧菌。Moss等[7]發(fā)現(xiàn)，對(duì)蝦腸道優(yōu)勢菌為弧菌屬、氣單胞菌屬和假單胞菌屬。王祥紅等[8]發(fā)現(xiàn)，弧菌屬和發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)在野生中國明對(duì)蝦腸道中為優(yōu)勢菌屬。劉淮德等[9]指出中國明對(duì)蝦腸道微生物主要由弧菌、光合細(xì)菌、不可培養(yǎng)細(xì)菌組成；弧菌為優(yōu)勢菌。Chaiyapechara等[10]從泰國8個(gè)養(yǎng)殖場取樣70尾斑節(jié)對(duì)蝦幼蝦，采用PCR梯度變性凝膠電泳和16S rDNA技術(shù)測定了腸道菌群的組成。結(jié)果表明，腸道細(xì)菌的常見細(xì)菌均屬于γ-變形菌門，每個(gè)蝦場對(duì)蝦的腸道優(yōu)勢菌群各不相同，分別屬于弧菌屬、發(fā)光桿菌屬、氣單胞菌屬、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)；且不同養(yǎng)殖水體中的對(duì)蝦其腸道菌群的結(jié)構(gòu)差別很大。

2.2 益生菌的篩選及應(yīng)用效果研究成果

引起對(duì)蝦病害的主要細(xì)菌為革蘭氏陰性菌，包括弧菌、假單胞菌、黃桿菌、氣單胞菌和交替單胞菌(Alteromonas)等，其中以弧菌為主[1]。病原性弧菌主要有哈氏弧菌(V.harvey)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、鰻弧菌(V.anguillarum)等。研究表明，益生菌制劑可以改善對(duì)蝦的腸道微生態(tài)構(gòu)成，提高對(duì)蝦生長率、成活率、免疫力及抗病力等。有益菌的抗病保護(hù)作用主要是通過以下兩種途徑：一是激活細(xì)胞和體液免疫系統(tǒng)，從而提高蝦體的免疫力；二是通過在蝦消化道中的競爭排斥作用減少腸道中的有害菌群，降低其致病機(jī)會(huì)。益生菌的競爭排斥和免疫刺激是對(duì)抗病原的有效機(jī)制[11]。還有研究表明，一些益生菌能阻止并修復(fù)由來自食物的抗原或藥物作用引起的黏膜層損害[12]。此外，益生菌還可以產(chǎn)生一些消化酶類，增強(qiáng)機(jī)體的消化能力，提高抗應(yīng)激能力和健康狀況。

用陸生生物的細(xì)菌作為水生動(dòng)物的益生菌往往效果并不理想，這是因?yàn)榫甑纳砩匦跃哂协h(huán)境依耐性[13]。因此許多從蝦塘或蝦的腸道及肝胰腺中分離益生菌菌株的報(bào)道大量涌現(xiàn)。筆者重點(diǎn)介紹對(duì)蝦益生菌的候選菌株、作用機(jī)制及其在對(duì)蝦養(yǎng)殖應(yīng)用上的挑戰(zhàn)，為對(duì)蝦益生菌產(chǎn)品的應(yīng)用開發(fā)提供參考。

2.2.1 芽孢桿菌

革蘭氏陽性菌，尤其是芽孢桿菌(Bacillus)可以產(chǎn)生大量的蛋白酶和淀粉酶等胞外酶，在對(duì)蝦中應(yīng)用可增加腸道脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶的活性，提高對(duì)蝦飼料的消化率；但是很難對(duì)蝦體自身消化酶和芽孢桿菌胞外酶進(jìn)行區(qū)分和定量[14]。Ziaei-Nejad等[15]評(píng)價(jià)了芽孢桿菌屬的益生菌對(duì)對(duì)蝦消化酶活性、生長和存活的影響，表明芽孢桿菌產(chǎn)生的酶類能有效將碳水化合物、脂類和蛋白降解成小分子物質(zhì)。雖然芽孢桿菌分泌大量胞外酶的優(yōu)勢特性是其被關(guān)注的重點(diǎn)，但是其對(duì)對(duì)蝦病原性弧菌的拮抗作用也有較多的報(bào)道，Vaseeharana等[16]指出枯草芽孢桿菌(B.subtilis)BT23在實(shí)驗(yàn)室條件下能抑制病原性弧菌。Balcázar等[17]從凡納濱對(duì)蝦腸道分離到的枯草芽孢桿菌UTM126對(duì)對(duì)蝦的致病菌副溶血弧菌PS-017有明顯的拮抗作用。但是體外拮抗效應(yīng)并不能反映體內(nèi)對(duì)病原菌的抑制效果，因此通過活體試驗(yàn)評(píng)價(jià)芽孢桿菌對(duì)病原性弧菌的抑制功效具有重要意義。

Rengpipat等[11,18]研究表明，飼喂芽孢桿菌S11菌株時(shí)斑節(jié)對(duì)蝦生長良好，抗菌能力增強(qiáng)，受到107個(gè)/mL 致病菌哈氏弧菌的人工感染以后，其存活率顯著高于對(duì)照組。Gullian等[19]從凡納濱對(duì)蝦中腸腺分離出益生菌芽孢桿菌P64菌株，對(duì)哈氏弧菌S2的抑制率為34%，在對(duì)蝦肝胰臟的定殖率為58%，表明該菌株具有益生菌和免疫刺激劑特性。Balcázar等[17]從凡納濱對(duì)蝦腸道分離到的枯草芽孢桿菌UTM126對(duì)對(duì)蝦的致病菌溶藻弧菌、副溶血弧菌和哈氏弧菌均有明顯的拮抗作用。飼喂含有105cfu/g益生菌的飼料28 d后，用105cfu/mL的哈氏弧菌浸泡攻毒，其死亡率僅為18.25%，顯著低于對(duì)照組的51.7%。朱學(xué)芝等[20]在基礎(chǔ)飼料中添加1010cfu/g的枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌(B.lincheniformis)飼喂初始體質(zhì)量約4.5 g的凡納濱對(duì)蝦，40 d后用107cfu/mL溶藻弧菌水浴攻毒。結(jié)果表明，芽孢桿菌能顯著提高凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞總量及血清酚氧化酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶的活性，增強(qiáng)其免疫機(jī)能；攻毒14 d內(nèi)，對(duì)照組的累計(jì)病死率顯著高于試驗(yàn)組。王玲等[21]的研究表明，在飼料中添加600 mg/kg的枯草芽孢桿菌制劑BS3755(2×109cfu/g)可以顯著提高凡納濱對(duì)蝦的生長率，降低飼料系數(shù)，并可以提高其非特異性免疫力(酸性磷酸酶、酚氧化物酶)。Liu等[22]從健康的凡納濱對(duì)蝦腸道中分離到枯草芽孢桿菌S12菌株。將此株菌以5×109cfu/kg、5×1010cfu/kg、5×1011cfu/kg、5×1012cfu/kg的劑量添加到對(duì)蝦飼料中，可顯著提高對(duì)蝦的生長和存活率；4周和8周時(shí)用哈氏弧菌攻毒的結(jié)果顯示，益生菌組的死亡率低于空白對(duì)照組。Hao等[23]表明, 凡納濱對(duì)蝦攝食含添加蠟質(zhì)芽孢桿菌(B.cereus)D4(107cfu/g)的飼料時(shí)，生長性能顯著提高；非特異性免疫性能如超氧化物歧化酶、呼吸爆發(fā)、酸性磷酸酶活性等均比對(duì)照組增強(qiáng)；用哈氏弧菌攻毒后，處理組的死亡率顯著低于對(duì)照組。Niu等[24]發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌LT3能夠在對(duì)蝦腸道中定殖，激活酚氧化酶原系統(tǒng)，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答，進(jìn)而提高了對(duì)蝦對(duì)抗坎氏弧菌(V.campbellii)的能力。

許多情況下直接在養(yǎng)殖水體中添加有益微生物，利用其拮抗病原、降解多余有機(jī)質(zhì)等，對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物產(chǎn)生有益的影響。芽孢桿菌在對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中的應(yīng)用非常廣泛，有關(guān)在蝦池中施用芽孢桿菌對(duì)水體和對(duì)蝦腸道菌群、對(duì)蝦免疫機(jī)能和抗應(yīng)激能力的影響也有較多報(bào)道。李卓佳等[25]對(duì)凡納濱對(duì)蝦的研究結(jié)果表明，施用芽孢桿菌制劑的蝦池對(duì)蝦腸道可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量為3.4×107cfu/g，優(yōu)勢菌群為弧菌屬和發(fā)光桿菌屬；未施用益生菌的蝦池細(xì)菌數(shù)量為5.8×1012cfu/g，優(yōu)勢菌群為假單胞菌屬和弧菌屬。蝦池施用芽孢桿菌制劑，可促進(jìn)養(yǎng)殖對(duì)蝦腸道微生物群落的代謝功能。Liu等[26]將一株自人類健康食品納豆中分離到的枯草芽孢桿菌E20應(yīng)用到凡納濱對(duì)蝦的育苗水體中，添加枯草芽孢桿菌E20 109cfu/L可以明顯加快幼蝦的發(fā)育，提高存活率；枯草芽孢桿菌E20還降低了水體的細(xì)菌總數(shù)和弧菌數(shù)；在進(jìn)行溫度、鹽度、氨氮脅迫時(shí)，益生菌組的后期幼體的累計(jì)死亡率明顯低于對(duì)照組，免疫相關(guān)酶基因表達(dá)顯著高于對(duì)照組。Zokaeifar等[14,27]研究發(fā)現(xiàn)，將分離到的枯草芽孢桿菌L10和G1分別以105cfu/mL和108cfu/mL的劑量添加至凡納濱對(duì)蝦的養(yǎng)殖池水中，水體的氨氮、亞硝酸鹽顯著降低；對(duì)蝦的特定生長率、飼料利用以及存活率均顯著提高；8周以后用哈氏弧菌ATCC14126攻毒，對(duì)照組的累積死亡率高達(dá)80%，而益生菌組的累積死亡率分別為36.7%和50%，說明枯草芽孢桿菌從多個(gè)角度改善了對(duì)蝦的生長性能、健康狀況和抗病力。

芽孢桿菌在對(duì)蝦養(yǎng)殖中經(jīng)常被用于降低弧菌數(shù)量，對(duì)抗魚蝦的多種病原菌?？紤]到芽孢桿菌屬的優(yōu)勢特征，它們將是對(duì)蝦養(yǎng)殖病害防控上良好的益生菌候選菌[28]。

2.2.2 乳酸菌

乳酸菌類可分泌特殊產(chǎn)物，還具有細(xì)胞表面的蛋白抗原和黏液黏附受體蛋白等生理生化特征，已經(jīng)作為益生菌廣泛應(yīng)用于陸生動(dòng)物和魚類養(yǎng)殖[29]。乳酸菌能使無菌動(dòng)物和常規(guī)小鼠腸道絨毛膜層細(xì)胞增殖，也能通過提高腸上皮細(xì)胞的成活率使腸道黏膜層的損傷修復(fù)[30]。

Chiu等[31]指出飼喂含植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的飼料，提高了凡納濱對(duì)蝦的免疫能力和抗弧菌感染能力，但是處理組的血細(xì)胞數(shù)降低。但實(shí)際生產(chǎn)過程中，水產(chǎn)飼料的調(diào)質(zhì)制粒環(huán)節(jié)需要高溫高濕和高壓的條件(溫度90～105 ℃)，才能使得飼料中的淀粉適度熟化保證飼料的耐水性等要求；而乳酸菌對(duì)高溫等的抗逆性較差，在該加工溫度下基本已完全滅活，因此在一定程度上限制了其在水產(chǎn)飼料上的直接應(yīng)用。Bussarin等[32]為了開發(fā)應(yīng)用于凡納濱對(duì)蝦飼料中的耐熱益生菌候選菌株，從經(jīng)過高溫處理后的健康對(duì)蝦中分離到2株乳酸菌菌株：腸道原著菌植物乳桿菌ID1L和外來菌乳酸短乳桿菌(L.brevis)860，它們均對(duì)弧菌等病原菌有拮抗作用；進(jìn)一步研究這兩株乳酸菌的熱適應(yīng)性能，并做現(xiàn)場飼料加工評(píng)價(jià)，證實(shí)該乳酸菌類在蝦料生產(chǎn)中采用高溫噴霧的方式可行。王國霞等[33]在凡納濱對(duì)蝦飼料中添加2.0×109cfu/mL的液體嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)發(fā)酵72 h，投喂8周。試驗(yàn)表明，10%乳酸菌添加可一定程度上提高凡納濱對(duì)蝦的生長性能和消化酶活性，改善其非特異性免疫力。

乳酸菌能夠產(chǎn)生抑制因子如細(xì)菌素以有效抑制革蘭氏陽性菌，但是水產(chǎn)養(yǎng)殖中很多病原菌是革蘭氏陰性菌，并且乳酸菌一般占水生動(dòng)物腸道菌總數(shù)的約10%，其抗逆性也較差，因此乳酸菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖上作為拮抗病原菌的益生菌的研究還有較大爭議[34]。盡管如此，由于乳酸菌具有分泌多種益生物質(zhì)、修復(fù)腸道損傷、提高機(jī)體非特異免疫機(jī)能、改善消化吸收等功效，因此在對(duì)蝦的健康維護(hù)上具有突出效果，進(jìn)而可以間接提高對(duì)蝦的抗病原菌能力。因此，乳酸菌在對(duì)蝦病害防控上的應(yīng)用效果依然值得肯定，但是需要通過后噴涂、拌料、篩選耐高溫菌株等方式解決乳酸菌抗逆性差的問題。

2.2.3 弧菌

多種弧菌是對(duì)蝦的病原菌。盡管溶藻弧菌的一小部分菌株是病原菌，但它的大多數(shù)菌株有著獨(dú)特的生物特性。Adams[35]的研究發(fā)現(xiàn)，熱滅活的溶藻弧菌能激活部分斑節(jié)對(duì)蝦的非特異性免疫反應(yīng)。Gullian等[19]從凡納濱對(duì)蝦中腸腺分離出益生菌弧菌P62和P63菌株，對(duì)哈氏弧菌S2的抑制率分別為54%和19%，在對(duì)蝦肝胰臟的定殖率分別為83%和60%，可能表現(xiàn)為益生菌特性而無免疫刺激特性。Alavandi等[36]從斑節(jié)對(duì)蝦的腸道中分離到河流弧菌(V.fluvialis)PM17作為益生菌的候選菌，因?yàn)樵摼甑暮Y選標(biāo)準(zhǔn)是其產(chǎn)胞外酶和鐵載體的能力以及其生長特性，沒有考慮其對(duì)對(duì)蝦免疫力的提高，因此河流弧菌PM17的應(yīng)用使斑節(jié)對(duì)蝦的血細(xì)胞數(shù)量、酚氧化酶活性和血淋巴抗菌活力隨著時(shí)間的延長卻逐漸下降。Balcázar等[17]證實(shí)從凡納濱對(duì)蝦腸道分離到的溶藻弧菌UTM102對(duì)對(duì)蝦的致病菌副溶血弧菌 PS-017有明顯的拮抗作用。

考慮到弧菌在對(duì)蝦養(yǎng)殖中的潛在病原特性，其益生菌菌株需要特別關(guān)注減低其轉(zhuǎn)化為病原菌的風(fēng)險(xiǎn)。

2.2.4 假單胞菌

假單胞菌是土壤、淡水和海水環(huán)境中的常見菌種，能夠產(chǎn)生大量的次生代謝產(chǎn)物抑制多種病原菌。假單胞菌和弧菌是對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境中的常見菌種。Chythanya等[37]篩選出一株對(duì)哈氏弧菌、河流弧菌、副溶血弧菌、美人魚弧菌(V.damsel)和創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificu)均有抑制作用的假單胞菌I-2，其抑菌物質(zhì)具有熱穩(wěn)定性，溶于氯仿，耐受蛋白酶的小分子化合物。Alavandi等[36]從斑節(jié)對(duì)蝦的腸道中分離到假單胞菌PM11作為益生菌的候選菌。Vijayan等[38]從半咸水湖泊中分離到一株假單胞菌PS-102，該菌株能夠抑制多種對(duì)蝦和沼蝦養(yǎng)殖環(huán)境中的病原性弧菌，其對(duì)溫度、pH和鹽度的廣泛耐受也表明該菌株是對(duì)蝦養(yǎng)殖的優(yōu)良益生菌候選菌。Balcázar等[17]從凡納濱對(duì)蝦腸道分離到的假單胞菌SLV22對(duì)對(duì)蝦的致病菌副溶血弧菌PS-017有明顯的拮抗作用。

2.2.5 其他益生菌

針對(duì)對(duì)蝦病原性弧菌的益生菌篩選有較多的研究，除了上述幾種外，還報(bào)道了其他一些益生菌候選菌株。李會(huì)榮等[39]從健康斑節(jié)對(duì)蝦幼體及其養(yǎng)殖環(huán)境中，分離出5 株對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病原菌哈氏弧菌和鰻弧菌等生長有抑制作用交替單孢菌。李繼秋[40]從中國明對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中分離出一株煙草節(jié)桿菌(Arthrobaternicotianae)XE-7，其對(duì)副溶血弧菌、鰻弧菌和沙蠶弧菌(V.neresis)有明顯拮抗作用。XE-7抑制水體弧菌的效果與氯霉素相當(dāng)；添加到飼料中能提高凡納濱對(duì)蝦的生長率和對(duì)副溶血弧菌的抵抗力。張新明[41]從健康的對(duì)蝦體內(nèi)及養(yǎng)殖水體中篩選到對(duì)鰻弧菌H-2、副溶血弧菌1614、沙蠶弧菌1623、漂浮弧菌(V.natriegen)1594等病原菌有拮抗作用的6株海洋細(xì)菌，其中微球菌J-10對(duì)病原菌的拮抗作用最強(qiáng)。將J-10添加到飼料中投喂凡納濱對(duì)蝦，對(duì)蝦的酚氧化酶活性、抗菌活力和溶菌活力、溶血素活性、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和血清蛋白含量等免疫指標(biāo)均優(yōu)于對(duì)照組。用副溶血弧菌進(jìn)行人工攻毒，免疫保護(hù)率達(dá)到40%。Balcázar等[17]從凡納濱對(duì)蝦腸道分離到的玫瑰桿菌(Roseobactergallaeciensis) SLV03對(duì)對(duì)蝦的致病菌副溶血弧菌PS-017有明顯的拮抗作用。張玲[42]從耐受過白斑病毒的中國明對(duì)蝦腸道中分離到一株海洋細(xì)菌嗜鹽單胞菌(Halomonas)B12，并從免疫學(xué)、腸道微生物學(xué)和組織學(xué)的角度，探討其對(duì)對(duì)蝦的作用機(jī)理。結(jié)果表明，飼料中添加7.18×1010cfu/g的海洋細(xì)菌嗜鹽單胞菌B12顯著提高了中國明對(duì)蝦腸道總菌數(shù)，降低了腸道弧菌數(shù)，提高中國明對(duì)蝦幼體的成活率和對(duì)哈氏弧菌和副溶血弧菌的抗病力，改善了對(duì)蝦養(yǎng)殖水體水質(zhì)。楊世平等[43]將從對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中分離到的沼澤生紅冬孢酵母(Rhodosporidiumpaludigenum)添加到凡納濱對(duì)蝦基礎(chǔ)飼料中，顯著減少了對(duì)蝦腸道內(nèi)弧菌數(shù)以及弧菌與總細(xì)菌的比例。Wen等[44]通過共培養(yǎng)及電鏡觀察表明，蛭弧菌(Bdellovibrio)DA5對(duì)溶藻弧菌有明顯的溶菌能力，試驗(yàn)感染的凡納濱對(duì)蝦存活率較高。

2.3 益生菌的使用方法是提高其功效的關(guān)鍵

益生菌使用的劑量、時(shí)間、使用方法(飼入、浸泡、口服、投水)、生物條件等是影響益生素有效性的關(guān)鍵因素[3]。一般認(rèn)為適宜的益生菌劑量為105cfu/mL以上，劑量過高或持續(xù)時(shí)間過長可能引起非特異性免疫系統(tǒng)的持續(xù)反應(yīng)而形成免疫抑制[45]。需要強(qiáng)調(diào)的是，用益生菌防控病害應(yīng)提前使用。一般來說，通過飼料攝入是益生菌使用方法中最為方便和實(shí)用的方式；浸泡法雖然效果較好，但是需要從蝦池中轉(zhuǎn)移蝦體，由此帶來的應(yīng)激較大；口服法一般是做成保健劑，然后與飼料進(jìn)行混合飼喂，勞動(dòng)強(qiáng)度較大，因此養(yǎng)殖戶難以堅(jiān)持執(zhí)行；投水法是直接將益生菌投放在養(yǎng)殖水體中，由于水體環(huán)境復(fù)雜多變，因此效果極不穩(wěn)定。因此，開發(fā)功能性益生菌飼料，是益生菌發(fā)揮良好效果的重要措施。

3 現(xiàn)狀與展望

目前對(duì)蝦中益生菌開發(fā)的研究大部分集中在對(duì)病原菌有顯著抑制作用或有效提高蝦體非特異性免疫機(jī)能的益生菌候選菌的篩選上，大多菌株來自蝦塘水體或底泥、對(duì)蝦腸道或肝胰腺，不過也有少數(shù)學(xué)者從發(fā)酵的泡菜等其他途徑篩選對(duì)抗弧菌的益生菌菌株。篩選到的菌株需要進(jìn)行安全性評(píng)估、藥敏試驗(yàn)、抗逆性試驗(yàn)、生長特性評(píng)價(jià)和優(yōu)化等一系列的評(píng)估[46]。而提高候選菌株的抗逆性是飼用益生菌面臨的最大難題。

而評(píng)價(jià)益生菌的應(yīng)用效果，一般采用微生物學(xué)、微生物生態(tài)學(xué)、組織學(xué)、免疫學(xué)、生理學(xué)和營養(yǎng)學(xué)等方法，探討益生菌的有益作用機(jī)制，包括生長和消化(消化酶、消化率、飼料轉(zhuǎn)化率)、免疫指標(biāo)(血細(xì)胞數(shù)、酚氧化酶活性、血漿蛋白濃度、超氧化物歧化酶、細(xì)胞吞噬率、抗菌活性、呼吸爆發(fā)活性等)、抗病力(注射或浸浴病原菌)、對(duì)腸道菌群和腸道組織的影響、對(duì)水質(zhì)和水體菌群組成的影響等。研究益生菌抗病效果，一般采用典型病原菌攻毒法。對(duì)病原菌菌株的選擇要有針對(duì)性，且最好探討對(duì)多種病原的免疫力，因?yàn)閷?shí)際生產(chǎn)中的病害爆發(fā)并不是某一種病原菌所致。益生菌的作用位點(diǎn)是腸道，對(duì)腸道的評(píng)價(jià)對(duì)于揭示益生菌的作用機(jī)理至關(guān)重要[47]，但是由于腸道環(huán)境的復(fù)雜，研究繁瑣，使得益生菌對(duì)機(jī)體腸道的作用機(jī)理研究較少，僅對(duì)益生菌腸道細(xì)菌總數(shù)、異養(yǎng)菌數(shù)量、病原菌數(shù)量等的影響進(jìn)行了簡單的比較研究，有關(guān)體內(nèi)的作用機(jī)制尚不清楚。

益生菌對(duì)對(duì)蝦疾病和健康的調(diào)控效力已經(jīng)比較確定[48]。但是受陸生動(dòng)物益生菌產(chǎn)品以及行業(yè)制度的制約，目前市場上的水產(chǎn)用益生菌產(chǎn)品多是芽孢桿菌和乳酸菌，少數(shù)產(chǎn)品也有和酵母菌組合。當(dāng)前應(yīng)用于對(duì)蝦養(yǎng)殖中的益生菌制劑菌種單一，針對(duì)性不強(qiáng)，作用效果不穩(wěn)定。一般來說，復(fù)劑比單一菌株的效果要好，而商業(yè)益生菌產(chǎn)品的復(fù)配多為缺乏依據(jù)的組合。此外有關(guān)益生菌和中草藥、免疫多糖及酶制劑的復(fù)配也值得關(guān)注。

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