劉玉偉 辛長勛 王碩 高梅 鄭書軒 時(shí)建立 彭喆 吳曉燕 王金寶 李俊

摘要：2016年，美國學(xué)者首次從患有皮炎腎病綜合征和繁殖障礙母豬體內(nèi)檢測到一種新發(fā)的豬圓環(huán)病毒，命名為豬圓環(huán)病毒3型（Porcine circovirus 3，PCV3）。山東省豬群已檢測出PCV3陽性感染，而對于山東省鴨類PCV3的感染情況未有報(bào)道。本研究采用PCR檢測方法，對山東省鴨場采集的146份樣品進(jìn)行PCV3檢測，檢出陽性率為零，表明山東省鴨類不存在PCV3感染。

關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒3型；鴨；PCR；山東省

中圖分類號：S858.322.65+9.5文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2018）05-0126-03

Abstract In 2016， a new type of porcine circovirus named as Porcine circovirus 3 （PCV3） from sows with dermatitis-nephritic syndrome and reproductive failure was first reported in America. PCV3 has been detected in sows and live-born infants in Shandong Province. However， the infection of PCV3 in ducks has not been reported. In this study， 146 samples were collected from duck farms in Shandong Province. The samples were tested by PCV3 PCR. The results showed zero positive. In conclusion， there was no PCV3 infection in ducks in Shandong Province.

Keywords Porcine circovirus 3； Duck； PCR； Shandong Province

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）是單股閉合環(huán)狀DNA 病毒，粒子直徑平均為17 nm，無囊膜，是目前已報(bào)道的最小的動(dòng)物類病毒[1]。豬圓環(huán)病毒是圓環(huán)病毒屬的代表種，根據(jù)其致病性、抗原性及核苷酸序列的差異性，將其劃分為豬圓環(huán)病毒1型（PCV1）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）和豬圓環(huán)病毒3型（PCV3）。

PCV1不產(chǎn)生細(xì)胞病變，不會(huì)引起豬的發(fā)病[2]。PCV2可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征[3]，同時(shí)還與母豬繁殖障礙[4]、豬皮炎與腎病綜合征[5]、豬壞死性及增生性肺炎[6]等疾病密切相關(guān)。世界各地規(guī)?；i場普遍存在PCV2感染，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成的危害不可估計(jì)。

2016年，美國學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了PCV3[7]。目前，山東省豬群已檢測出PCV3陽性感染[8，9]。有報(bào)道稱，中國的犬類也檢測出PCV3陽性感染[10]。山東省作為中國的養(yǎng)鴨大省，鴨類是否感染PCV3尚未報(bào)道。為了解山東省鴨群PCV3的情況，本研究從山東省6個(gè)鴨場隨機(jī)采集146份樣品，采用PCR檢測方法進(jìn)行PCV3檢測，以期為山東省鴨類是否受PCV3的威脅提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在山東省的6個(gè)鴨場隨機(jī)采集116份血清和30份組織樣品（淋巴結(jié)、脾臟、肺臟）。

1.2 主要試劑與儀器

10%十二烷基硫酸鈉（SDS）、蛋白酶K、Tris飽和酚均購自北京Solarbio公司；無水乙醇、70%乙醇和三氯甲烷均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；雙蒸水購自生工生物工程（上海）股份有限公司；DL-2000 DNA Marker購自大連寶生物工程有限公司；2×Taq PCR StarMix購自上海起發(fā)實(shí)驗(yàn)試劑有限公司。

組織裂解器購自德國QIAGEN公司；DK-8D型電熱恒溫水槽購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；移液槍和臺(tái)式離心機(jī)均購自德國Eppendorf公司；PTC-2000型PCR儀購自美國MJ Research公司；凝膠成像儀購自Alpha Innotech公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù) GenBank公布的PCV3 基因序列，在其高度保守區(qū)域，利用Primer Premier 5.0軟件輔助設(shè)計(jì)一對特異性引物，擴(kuò)增片段為330 bp。由生工生物工程（上海）股份有限公司負(fù)責(zé)合成引物。引物序列見表1。

1.3.2 DNA提取 根據(jù)《動(dòng)物病毒學(xué)》[11]，采用SDS-蛋白酶K法提取DNA。

1.3.3 PCR擴(kuò)增 將提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)采用20 μL體系，依次在反應(yīng)管中加入2×Taq PCR StarMix 10 μL、PCV3-F 1 μL、PCV3-R 1 μL、DNA模板1 μL，最后加雙蒸水至體積為20 μL。同時(shí)設(shè)立陰性對照和陽性對照。

反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min；94℃變性20 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取出5 μL產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。剩余產(chǎn)物保存于4℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用所設(shè)計(jì)的PCV3引物對陰、陽性樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。圖1所示， PCV3陽性樣品可擴(kuò)增出1條約330 bp條帶，與預(yù)期片段大小相符；陰性樣品無條帶。

2.2 臨床樣品檢測結(jié)果

圖2為部分樣品PCV3檢測結(jié)果。 146份臨床樣品均為PCV3陰性，陽性率為零。由于本次調(diào)查僅選取山東省內(nèi)6個(gè)鴨場且在冬季進(jìn)行檢測，氣溫較低且穩(wěn)定，使得鴨群疾病發(fā)生率較低，所以調(diào)查結(jié)果可能存在一定的片面性與局限性，更加全面有效的PCV3感染情況有待于進(jìn)一步的調(diào)查研究。

3 討論與結(jié)論

自2016年美國首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道PCV3以來，中國等國家豬群相繼檢測出PCV3陽性感染，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成的損失不容忽視。隨著中國犬類感染PCV3的報(bào)道，PCV3的陽性感染與防控得到越來越多的關(guān)注與重視。目前，對于PCV3的研究還處于初級階段，市場嚴(yán)重缺乏針對性的疫苗和藥物。鑒于PCV3存在傳播速度快、途徑多、范圍廣的特征，今后在飼養(yǎng)過程中需要更加重視PCV3的研究和監(jiān)控工作。首先，豬場需要加強(qiáng)生物安全體系，提高飼養(yǎng)管理水平，增強(qiáng)豬群免疫力，切斷病毒和有害細(xì)菌傳播途徑；其次，加快開展相關(guān)檢測技術(shù)的研究，建立PCV3快速、靈敏、特異的血清學(xué)檢測方法及相關(guān)檢測技術(shù)，如利用膠體金免疫層析技術(shù)制備PCV3抗原檢測試紙條等，對出入口岸農(nóng)畜產(chǎn)品進(jìn)行PCV3快速篩查；最后，分離與鑒定 PCV3毒株，進(jìn)而開展疫苗研發(fā)與動(dòng)物回歸試驗(yàn)，為我國養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展保駕護(hù)航。

山東省鴨類養(yǎng)殖規(guī)模較大，目前尚無山東省鴨群存在PCV3陽性感染的報(bào)道。本次調(diào)查沒有檢測出山東省鴨類PCV3的陽性感染，初步表明，目前山東省鴨類不存在PCV3感染，說明PCV3對山東省鴨群暫時(shí)沒有造成威脅。推測PCV3主要在哺乳動(dòng)物體內(nèi)引起感染，鳥類不會(huì)感染此病毒。

參 考 文 獻(xiàn)：

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