孫紅煒 徐曉輝 李凡 高瑞 楊淑珂 路興波
摘要:本試驗用田間接蟲和室內生測方法,研究國產轉基因玉米雜交種瑞豐1號-雙抗12-5(RF1-12-5)對3種主要的玉米鱗翅目害蟲亞洲玉米螟、黏蟲、棉鈴蟲的抗性。田間結果表明:RF1-12-5對亞洲玉米螟、棉鈴蟲的抗性在相應的鑒定時期均達到高抗水平,RF1-12-5心葉期對黏蟲的抗性為抗性水平。室內鑒定結果表明:心葉期,RF1-12-5對亞洲玉米螟抗性起效較慢,飼喂48~72 h后校正死亡率分別為63.97%、77.14%、88.00%;吐絲期飼喂48 h后校正死亡率達100%,抗性顯著;籽粒期飼喂24、48、72 h后校正死亡率分別為68.86%、83.96%、98.03%。心葉期飼喂24 h后對黏蟲基本無抗性效果,但48、72 h后的校正死亡率分別達到94.64%、100%。吐絲期飼喂24 h后對棉鈴蟲抗性達到87.59%,48 h后對棉鈴蟲校正死亡率達到100%,抗性較強??傮w來看,RF1-12-5田間對亞洲玉米螟、棉鈴蟲抗性較高,對黏蟲抗性略低;室內心葉期對亞洲玉米螟抗性較弱,但在其他時期對亞洲玉米螟、黏蟲、棉鈴蟲均表現了較好的抗性。因此RF-12-5具有推廣應用的潛力。
關鍵詞:抗蟲耐除草劑玉米;瑞豐1號-雙抗12-5;鱗翅目害蟲;田間抗蟲性;室內抗蟲性
中圖分類號:S513.037文獻標識號:A文章編號:1001-4942(2018)05-0109-06
Abstract Through filed experiments and indoor bioassay, the resistances of domestic transgenic maize hybride Ruifeng 1-Double Resistance 12-5(RF1-12-5) against three major maize lepidopteran pests, Pyrausta nubilalis, Mythimna separate and Helicoverpa armigera were studied. The results of the filed experiments showed that the resistance of RF1-12-5 against Ostrinia furnacalis and Helicoverpa armigera were in high level during the corresponding identification periods. The resistance against Mythimna separate was in moderate level during the whorl stage. The indoor bioassay results showed that RF1-12-5 had slower resistance against Ostrinia furnacalis at whorl stage. After feeding with RF1-12-5 leaves for 24,48 and 72 hours, the corrected mortality rates were respectively 63.97%, 77.14% and 88.00%. At filamentous stage, the resistance was significant and the corrected mortality rate reached 100% after 48 hours. During the grain period, the corrected mortality rates were respectively 68.86%, 83.96% and 98.03% after 24,48 and 72 hours. For Mythimna separate, at whorl stage, there was no obvious resistant effect after 24 hours, but the corrected mortality rates were 94.64% and 100% respectively after 48 and 72 hours. For Helicoverpa armigera, RF1-12-5 showed obvious resistance at filamentous stage and the corrected mortality rates were 87.59% and 100% after 24 and 48 hours respectively. In all,RF1-12-5 showed obvious field resistance against Ostrinia furnacalis and Helicoverpa armigera,but lower resistance against Mythimna separate. It showed lower resistance against Ostrinia furnacalis at whorl stage during indoor bioassay, but better resistance against Ostrinia furnacalis, Mythimna separate and Helicoverpa armigera at other stages. We concluded that RF1-12-5 had the potential for popularization and application in the future.
Keywords Insect-and herbicide-resistant maize; Ruifeng 1-Double Resistance 12-5; Lepidopteran pests; Field insect resistance; Indoor insect resistance
玉米是我國重要的糧食作物和加工原料,在我國糧食生產中占據重要位置。亞洲玉米螟、黏蟲和棉鈴蟲是影響玉米產量的三大主要鱗翅目害蟲,在個別年份,害蟲的為害甚至會造成玉米絕收[1,2]。長期以來,農業(yè)生產中均采用化學方法對鱗翅目害蟲進行防治。但化學防治對環(huán)境危害大,同時存在防治不及時的缺點。隨著生物技術的發(fā)展,轉基因玉米轉化體系早已成熟,國外研發(fā)的轉基因抗蟲、耐除草劑、品質改良玉米自1996年起相繼在美國、巴西、阿根廷等國家進行推廣應用,取得較好的防治效果,大大減少農藥的使用,減輕環(huán)境污染,降低勞動力成本。近20年來,轉基因作物種植面積不斷擴大[3]。我國自2008年啟動轉基因重大專項,目前已有眾多的轉基因玉米進入不同階段試驗,轉植酸酶玉米于2009年底取得生物安全證書[4]。而對轉基因抗蟲及耐除草劑玉米的研究最多,也最成熟[5-7]。從技術儲備、生產地位等各方面綜合分析,轉基因玉米是最有可能首先在我國推廣應用的糧食作物,具有廣闊的應用前景[8-10]。雙抗12-5是浙江大學研發(fā)的含有抗蟲基因cry1Ab/cry2Aj與耐除草劑基因G10evo的轉基因玉米新品系[11], cry1Ab/cry2Aj對亞洲玉米螟有較高的殺蟲活性,草甘膦靶標酶基因G10evo對草甘膦具有很高的耐受性[12-16]。本試驗旨在研究雙抗12-5衍生品種瑞豐1號-雙抗12-5對玉米重要鱗翅目害蟲的抗性,以期為該品種在生產上推廣提供技術依據。
1 材料與方法
1.1 試驗材料
供試玉米品種:瑞豐1號-雙抗12-5(簡稱RF1-12-5,轉基因玉米)、瑞豐1號(簡稱RF1,為RF1-12-5的雜交親本)、綜31(感蟲對照品種)、登海3號(簡稱DH3,當地品種)。RF1-12-5、RF1由浙江大學提供,綜31由中國農業(yè)科學院提供,DH3購自當地種子市場。
供試昆蟲:亞洲玉米螟、黏蟲、棉鈴蟲,均由本研究室人工繁殖。
1.2 試驗設計
試驗于2016年在農業(yè)部轉基因植物環(huán)境安全監(jiān)督檢驗測試中心(濟南)環(huán)境安全試驗基地進行。所有玉米品種全生育期不噴施殺蟲劑,常規(guī)方式播種及管理。隨機區(qū)組設計,每品種3次重復。小區(qū)面積為30 m2(5 m×6 m),行株距60 cm×25 cm,小區(qū)間設2 m間隔,以防害蟲在不同小區(qū)之間擴散。
1.3 田間抗蟲性鑒定
亞洲玉米螟田間抗蟲鑒定:玉米心葉期(6~8葉期)和吐絲期分別間隔3 d人工傍晚接種初孵幼蟲2次。心葉期接種到心葉內,吐絲期接種到花絲上。每小區(qū)人工接蟲40株,每株接蟲30~40頭,最后一次接蟲14 d后調查。
心葉期調查:調查接蟲株中上部葉片亞洲玉米螟為害程度,包括受害葉片上的蟲孔大小、數量及分布等,計算食葉級別及食葉級別平均值,根據食葉級別平均值判定玉米心葉期對玉米螟的抗性水平。為害程度分級標準及抗性評價標準參照NY/T 1248.5—2006[17]的規(guī)定。
吐絲期調查:根據雌穗被害情況、蛀孔數量、隧道長度(cm)及存活幼蟲齡期數量等,計算各小區(qū)穗期雌穗被害級別平均值。按照雌穗被害級別平均值判定玉米穗期對亞洲玉米螟的抗性水平。雌穗被害級別分級標準及抗性評價標準參照農業(yè)部953號公告—10.1—2007[18]的規(guī)定。
黏蟲田間抗蟲鑒定:玉米4~6葉期接蟲,接蟲方法及接蟲次數同亞洲玉米螟。最后一次接蟲14 d后調查玉米葉片受黏蟲為害程度及幼蟲存活數,記錄心葉被害級別并計算心葉期食葉級別平均值,判定玉米心葉期對黏蟲的抗性水平。為害程度分級標準及抗性評價標準參照農業(yè)部953號公告—10.1—2007[18]的規(guī)定。
棉鈴蟲田間抗蟲鑒定:玉米吐絲期接蟲,接蟲方法及接蟲次數同亞洲玉米螟。最后一次接蟲14 d后調查雌穗被害率、幼蟲存活數、雌穗被害長度,確定雌穗被害級別并計算雌穗被害級別平均值,判定玉米對棉鈴蟲的抗性水平。雌穗被害級別分級標準及抗性評價標準參照農業(yè)部953號公告—10.1—2007[18]的規(guī)定。
1.4 室內抗蟲性鑒定
亞洲玉米螟: 于玉米心葉期、吐絲期、籽粒期分別采集相應幼嫩組織飼喂2日齡幼蟲,每玉米生育期重復6次,每重復10頭幼蟲。飼喂 24、48、72 h后調查幼蟲死亡率。
黏蟲:玉米心葉期采集相應幼嫩心葉飼喂2日齡幼蟲,重復6次,每重復10頭幼蟲,飼喂24、48、72 h后調查幼蟲死亡率。
棉鈴蟲:玉米吐絲期采集幼嫩花絲飼喂2日齡幼蟲,重復6次,每重復10頭幼蟲,飼喂24、48、72 h后調查幼蟲死亡率。
飼喂時,每天更換相應的新鮮幼嫩組織。室內抗蟲性鑒定時,對照組幼蟲死亡率>20%放棄試驗結果,對照組幼蟲死亡率<20%計算校正死亡率。本試驗中,對照組幼蟲死亡率為非轉基因玉米RF1和DH3幼蟲死亡率平均值。
校正死亡率(%)=(處理組幼蟲死亡率-對照組幼蟲平均死亡率)/(1-對照組幼蟲平均死亡率)×100。
2 結果與分析
2.1 田間抗性鑒定結果
2.1.1 亞洲玉米螟田間抗性鑒定 玉米心葉期接蟲后1周左右,非轉基因玉米葉片出現數量較多的1~2 mm左右蟲孔,轉基因抗蟲玉米蟲孔數量很少,14 d后的調查結果如表1所示,心葉期RF1-12-5食葉級別平均值為1.87,DH3、 RF1、綜31分別為5.21、7.44、8.56。按玉米對玉米螟的評價標準,心葉期RF1-12-5對亞洲玉米螟的田間抗性達到高抗水平, RF1、綜31達到感蟲水平, DH3達到中抗水平。
吐絲期,RF1-12-5接蟲株雌穗及花絲基本未受害,僅少量花絲枯死,雌穗被害級別平均值為1.07,而DH3、 RF1、綜31的花絲及雌穗受害嚴重,部分有活蟲,花絲枯死,穗尖大部分籽粒被啃食,三者雌穗被害級別平均值分別為5.77、7.13、5.67。按玉米雌穗對亞洲玉米螟的評價標準判斷,吐絲期DH3、 RF1、綜31對亞洲玉米螟均為感蟲水平,而RF1-12-5達到高抗水平(表1)。
2.1.2 黏蟲田間抗性鑒定結果 接種黏蟲后,4個品種玉米均有黏蟲為害癥狀。 RF1、綜31為害重,DH3略輕,表現為蟲孔多,單個蟲孔較大,甚至有缺刻。RF1-12-5黏蟲為害癥狀輕,表現為單個蟲孔較小,蟲孔數量較少。RF1、綜31食葉級別平均值分別為6.31、6.64,均達到感蟲水平, DH3平均值略低,為5.88,達到中抗水平,RF1-12-5則為2.67,到達抗性水平(表2)。
2.1.3 棉鈴蟲田間抗性鑒定結果 接種棉鈴蟲后,DH3、RF1、綜31棉鈴蟲為害癥狀明顯,表現為花絲完全受害,禿穗,穗尖被棉鈴蟲啃食,有活蟲;而RF1-12-5花絲基本未受害,雌穗完整,未受害。DH3、RF1、綜31雌穗被害級別平均值均大于5.1,對棉鈴蟲抗性均表現為感蟲水平,雌穗被害率93.33%~100%,5級以上為害較多,平均每株活蟲數為0.5頭以上; RF1-12-5雌穗被害級別平均值僅為0.30,對棉鈴蟲的抗性達到高抗水平,雌穗被害率雖然為20.00%,但均為1級、2級為害,未發(fā)現活蟲存在(表3)。
2.2 室內抗蟲性鑒定結果
2.2.1 亞洲玉米螟室內抗蟲性鑒定 由表4可知,玉米心葉期葉片飼喂亞洲玉米螟24 h后,DH3、RF1幼蟲死亡率在10%以內, RF1-12-5的幼蟲死亡率為66.67%,校正死亡率為63.97%。48 h后,DH3、RF1幼蟲死亡率大于10%, RF1-12-5則為80.00%,校正死亡率為77.14%;72 h后,DH3、RF1幼蟲死亡率接近20%, RF1-12-5達90.00%,校正死亡率為88.00%。
吐絲期DH3、RF1飼喂亞州玉米螟24 h后死亡率在5%左右, RF1-12-5為93.33%,校正死亡率為93.02%;48 h后DH3、RF1飼喂玉米螟死亡率在10%以內, RF1-12-5飼喂玉米螟死亡率為100%;72 h后DH3RF1飼喂亞洲玉米螟死亡率在15%左右,RF1-12-5達100%。(表4)。
籽粒期飼喂亞州玉米螟24 h后,DH3、RF1幼蟲死亡率在10%以內, RF1-12-5則為71.33%,校正死亡率為68.86%;48 h后DH3、RF1幼蟲死亡率10%左右,RF1-12-5為85.67%,校正死亡率為83.96%;72 h后DH3、RF1幼蟲死亡率接近20%,RF1-12-5為98.37%,校正死亡率為98.03%(表4)。
總體來看, 室內RF1-12-5吐絲期對亞洲玉米螟抗性高于心葉期和籽粒期。
2.2.2 黏蟲室內抗蟲性鑒定 飼喂24 h后,RF1-12-5對黏蟲有一定抗蟲效果,校正死亡率為8.47%; 48 h后,DH3、RF1黏蟲幼蟲死亡率在10%以內,RF1-12-5則為95.00%,校正死亡率為94.64%,表現較強的抗性效果; 72 h后,DH3、RF1黏蟲幼蟲死亡率分別為6.67%、13.33%, RF1-12-5為100%(表5)??傮w來看,RF1-12-5對黏蟲室內抗性起效較慢,飼喂48 h后才有明顯的抗性,但后續(xù)抗性效果較好,飼喂48~72 h后可明確判斷抗性效果。
2.2.3 棉鈴蟲室內抗蟲性鑒定 飼喂24 h后, DH3、RF1幼蟲死亡率低于10%,RF1-12-5則為88.33%,校正死亡率為87.59%;48 h后,DH3、RF1幼蟲死亡率均增加至10%左右,RF1-12-5則為100%(表6)。RF1-12-5室內對棉鈴蟲同樣表現出明顯的抗性。飼喂24~48 h后可明確判斷抗蟲效果高低。
3 討論與結論
轉基因作物目標性狀是否如期高效表達,并在實踐中對靶標生物起到切實作用,是決定一種轉基因作物能否進行后期推廣、應用的關鍵。RF1-12-5中的抗蟲基因cry1Ab/cry2Aj表達的Bt蛋白理論上對鱗翅目害蟲具有較高的殺蟲活性,本研究采用田間人工接蟲及室內組織飼喂兩種方式就RF1-12-5對3種主要玉米鱗翅目害蟲亞洲玉米螟、黏蟲、棉鈴蟲的抗性進行研究,明確其對3種害蟲的抗性效果。
亞洲玉米螟6月上、中旬為第1代卵盛期,第1代幼蟲群居于玉米心葉喇叭口處或嫩葉上取食葉片表皮及葉肉后潛入心葉內蛀食心葉,使被害葉呈半透明薄膜狀或成排的小圓孔。 8月上、中旬第3代卵盛期,第3代幼蟲發(fā)生在夏玉米穗期,在玉米打苞后鉆入苞內,抽雄后即向下轉移,蛀入莖內為害。因此,兩次發(fā)生盛期即夏玉米6~8葉期、花絲期是控制亞洲玉米螟為害的關鍵時期。本研究田間鑒定結果表明,瑞豐1號-雙抗12-5在這兩個時期對玉米螟抗性表現明顯,蟲孔極少且孔徑小,食葉級別平均值分別為1.87、1.07,遠低于瑞豐一號和登海3號,對亞洲玉米螟均表現為高抗水平,抗蟲效果顯著,這與常雪等的研究結果一致[19]。本研究對亞洲玉米螟室內抗蟲鑒定表明,心葉期飼喂72 h后校正死亡率為88.00%;籽粒期飼喂72 h后校正死亡率達到98.03%,吐絲期飼喂48 h后校正死亡率即可達100%,吐絲期對亞洲玉米螟抗性高于心葉期和籽粒期。常雪的室內鑒定結果[19]同樣表明,雙抗12-5在心葉期對亞洲玉米螟抗性較吐絲期和雌穗期低,這與常雪發(fā)現Bt蛋白表達量在吐絲期高于心葉期的研究結果相符。王江等[20]對雙抗12-5的研究表明,雙抗12-5對玉米螟田間達高抗水平,室內生測表明心葉期、吐絲期接蟲后第5 d幼蟲死亡率達90%,最終效果與本研究基本一致,抗性發(fā)揮時間差異可能是蟲源不同或者飼養(yǎng)條件差異所致。與國外廣泛推廣品種Bt11相比,RF1-12-5對玉米螟的抗性并不遜色[21]。
黏蟲是我國著名的遷飛性、暴食性及雜食性害蟲,本身具有較強的環(huán)境適應能力。黏蟲在山東1年發(fā)生3代,第2代危害夏玉米。1、2齡幼蟲啃食葉肉成天窗,3齡以后沿葉緣蠶食成缺刻,危害嚴重時吃光大部葉片,只殘留很短的中脈。常雪等[22]對國外轉cryIAb基因玉米Yield Gard的黏蟲抗性研究發(fā)現,接種黏蟲10 d后黏蟲死亡率接近100%。本研究田間鑒定結果表明,瑞豐1號-雙抗12-5對黏蟲抗性較玉米螟低,接蟲196 h食葉級別平均值為2.67,達到抗性水平,而室內鑒定雖然抗性起效較慢,但隨著飼喂時間延長,同樣表現出較好的抗性效果。由于黏蟲幼蟲為多食性害蟲,具有遷移危害的習性,因此,各齡期幼蟲均有可能發(fā)生,抗蟲玉米不同生育期、不同器官Bt蛋白表達量均有差異[19],因此有必要采用不同生育期的相應組織器官對各齡期黏蟲幼蟲進行抗性鑒定,以便更全面地研究抗蟲玉米對黏蟲的抗性。
棉鈴蟲一般第4代為害夏玉米。夏玉米棉鈴蟲卵80%左右落在夏玉米抽出但未散粉的雄穗上,卵孵化后幼蟲集中在雌穗頂端花絲上取食。從吐絲期鑒定結果看,瑞豐1號-雙抗12-5 田間及室內對棉鈴蟲均有很好的抗性效果,田間雌穗被害率低,為20.00%,且多為低級別為害,未調查到活蟲,抗性達高抗水平;室內鑒定校正死亡率48 h后達100%。常雪等[22]對國外品種Yield Gard的田間鑒定結果表明,雌穗被害率為3.5%,危害級別為0.007,百株存活幼蟲14.3頭。盡管二者之間存在一定差異,但差異是由接蟲數量及調查方法不同所致。本試驗中,瑞豐1號-雙抗12-5田間接蟲并未調查到活蟲存在,表明瑞豐1號-雙抗12-5可以很好地控制棉鈴蟲為害,且抗蟲效果完全達到國外品種水平。
田間抗性鑒定受田間自然條件的影響,接蟲后幼蟲存活率較低,但存活下來的幼蟲生活力強,在非轉基因植株及感蟲品種上很容易造成可見的、明顯的為害癥狀,能夠直接反映出植物的田間抗性表現。室內抗性鑒定由于飼養(yǎng)條件變化較大,不同昆蟲對環(huán)境適應性差別較大,有時對照死亡率較高,影響抗性的判斷。但由于Bt蛋白發(fā)揮作用較快,一般接蟲后24~48 h可看到明顯的效果。本研究表明,國產轉基因玉米瑞豐1號-雙抗12-5對亞洲玉米螟、黏蟲、棉鈴蟲具有理想的抗性效果。
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