(1.山東大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南 250012； 2.石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)(石家莊)有限公司，石家莊 050051)

甲鈷胺屬于輔酶型的一種維生素，甲鈷胺甲基化的官能團(tuán)能夠參與到體內(nèi)甲基轉(zhuǎn)移作用中，從而對(duì)體內(nèi)神經(jīng)組織核酸、蛋白質(zhì)和脂肪的新陳代謝等都具有良好促進(jìn)作用。在人體代謝中，甲鈷胺和腺苷鈷胺能夠直接參與體內(nèi)代謝，對(duì)疾病起到直接治療作用。從甲鈷胺的結(jié)構(gòu)形式來(lái)說(shuō)，甲基VB12要比普通氰鈷VB12療效更好，因此可以說(shuō)甲基VB12未來(lái)將是氰鈷VB12的一個(gè)更新?lián)Q代產(chǎn)品。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在對(duì)甲鈷胺臨床作用研究中發(fā)現(xiàn)甲鈷胺對(duì)于糖尿病的周圍神經(jīng)病變擁有良好治療作用，能夠改善糖尿病周圍神經(jīng)的形態(tài)，讓神經(jīng)損害得以修復(fù)。此外，甲鈷胺還在三叉神經(jīng)痛、面神經(jīng)炎治療等領(lǐng)域有良好治療作用。

在這種情形下，開(kāi)展甲鈷胺原料藥工藝技術(shù)研究開(kāi)發(fā)與生產(chǎn)，生產(chǎn)出成本低、質(zhì)量高、對(duì)環(huán)境污染小的產(chǎn)品，滿足臨床用藥需求，具有重大現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與原料

甲鈷胺制備與質(zhì)量控制的材料見(jiàn)表1。

表1 甲鈷胺制備與質(zhì)量控制的材料

1.2 制備路線

氰鈷胺→還原→還原態(tài)氰鈷胺→甲基化→ 甲基氰鈷胺溶液→樹(shù)脂吸附→洗脫液→結(jié)晶→干燥→成品→包裝。

1.3 質(zhì)量控制

1.3.1 鑒別

(1)避光操作，分別取本品和對(duì)照品各約5 mg，置100 mL容量瓶中，加水溶解，定容至刻度，搖勻備用。照紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，進(jìn)行波長(zhǎng)掃描檢測(cè)，供試品溶液在220～550 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜應(yīng)與對(duì)照品溶液的一致。(在266 nm、342 nm、525 nm處有最大吸收)。

(3)在含量測(cè)定項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品溶液主峰的保留時(shí)間應(yīng)與甲鈷胺對(duì)照品溶液主峰的保留時(shí)間一致。

(4)取本品按照紅外光譜測(cè)定法進(jìn)行紅外光譜測(cè)定后，將本品的紅外光吸收?qǐng)D譜應(yīng)與對(duì)照的圖譜(光譜集732圖)一致。

1.3.2 水分測(cè)定

精密稱定本品約0.1g，按照卡爾費(fèi)休水分滴定儀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程測(cè)定。同法測(cè)定對(duì)照品。

偏差：同樣方法同時(shí)測(cè)定3個(gè)平行樣，3個(gè)數(shù)據(jù)的RSD應(yīng)≤5.0%，取平均值報(bào)告。

1.3.3 含量測(cè)定

流動(dòng)相的配制：

稱取磷酸二氫鉀4.1 g，置1000 mL容量瓶中，加純化水溶解并稀釋至刻度，搖勻，用磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.5后，用0.45 μm的水系微孔濾膜過(guò)濾，即得0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液。將乙腈與0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液按16∶84的比例混合均勻，放入超聲波水浴中脫氣10分鐘，即得。

供試品溶液的配制：

稱取本品25±2.5 mg于稱量瓶?jī)?nèi)，將稱量瓶放入漏斗中，將樣品經(jīng)漏斗倒入50 mL容量瓶中，用流動(dòng)相沖洗稱量瓶及漏斗，洗液并入容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度搖勻，再精密量取5 mL，置于50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度搖勻，即為供試品溶液。供試品溶液使用前經(jīng)油系微孔濾膜(0.45 μm)過(guò)濾。

對(duì)照品溶液的配制：

取甲鈷胺對(duì)照品同供試品溶液配制方法，配制對(duì)照品溶液。

色譜條件：

色譜柱：C18柱；檢測(cè)波長(zhǎng)：342 nm；柱溫：40 ℃。

流速：調(diào)節(jié)流速使甲鈷胺峰的保留時(shí)間約為12分鐘(11.5分鐘至12.5分鐘)。

測(cè)試過(guò)程：

照液相色譜儀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程依法操作。取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。

系統(tǒng)適用性：

系統(tǒng)表現(xiàn)：取甲鈷胺對(duì)照品25±2.5 mg，置50 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，在自然光下放置5～10分鐘，取20 μL注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)流速使甲鈷胺峰的保留時(shí)間約為12分鐘，記錄色譜圖，甲鈷胺峰與羥鈷胺峰(相對(duì)保留時(shí)間約為0.2)的分離度應(yīng)大于20，甲鈷胺峰與相鄰雜質(zhì)峰之間的分離度應(yīng)>1.5。

系統(tǒng)重現(xiàn)性：取對(duì)照品溶液20μL注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣5針，所得5張圖譜中主峰面積的RSD≤2.0%。

偏差：取對(duì)照品K值的平均值計(jì)算，對(duì)于同一種方法要同時(shí)測(cè)定兩個(gè)平行樣，RD應(yīng)≤0.5%。

K對(duì)：對(duì)照溶液主峰面積/所稱對(duì)照品的重量(g)；

K樣：供試品溶液主峰面積/所稱供試品的重量(g)；

C：對(duì)照品百分含量；

W對(duì)：對(duì)照品水分；

W樣：供試品水分；

A：對(duì)照溶液(供試品溶液)主峰面積；

G：所稱對(duì)照品(供試品)的重量(g)。

1.3.4 有關(guān)物質(zhì)

流動(dòng)相的配制：

稱取磷酸二氫鉀4.1 g，置1000 mL容量瓶中，加純化水溶解并稀釋至刻度，搖勻，用磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.5后，用0.45 μm的水系微孔濾膜過(guò)濾，即得0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液。將乙腈與0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液按16∶84的比例混合均勻，放入超聲波水浴中脫氣10分鐘，即得。

供試品溶液的配制：

取本品25±2.5 mg于稱量瓶?jī)?nèi)，將稱量瓶放入漏斗中，將樣品經(jīng)漏斗倒入50 mL容量瓶中，用流動(dòng)相沖洗稱量瓶及漏斗，洗液并入容量瓶中。加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。使用前經(jīng)0.45 μm的油系微孔濾膜過(guò)濾。

對(duì)照液配制：

精密量取供試品溶液0.5 mL，置50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度搖勻，作為對(duì)照液。使用前經(jīng)0.45 μm的油系微孔濾膜過(guò)濾。

色譜條件：

色譜柱：C18柱；檢測(cè)波長(zhǎng)：342 nm；柱溫：40 ℃。

流速：調(diào)節(jié)流速使甲鈷胺峰的保留時(shí)間約為12分鐘(11.5分鐘至12.5分鐘)

測(cè)試過(guò)程：

照液相色譜儀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程依法操作。取供試品溶液與對(duì)照溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的3倍。記錄供試品溶液的色譜圖中最大單個(gè)雜質(zhì)峰面積、雜質(zhì)峰面積之和及對(duì)照液主峰面積。

偏差：同一方法測(cè)定兩個(gè)平行樣，RD應(yīng)≤5.0%，取兩個(gè)結(jié)果的算術(shù)平均值報(bào)告。

計(jì)算公式：

2 甲鈷胺制備工藝研究

2.1 還原反應(yīng)的催化劑及限制試劑的選取

根據(jù)專利和文獻(xiàn)報(bào)道[1-3]，國(guó)際上制備甲鈷胺所采用的還原劑為硼氫化鈉。但硼氫化鈉是一種強(qiáng)還原劑，直接把維生素B12的中心三價(jià)鈷離子還原成一價(jià)態(tài)、能把β位上氰根還原掉，也使α位上的苯并咪唑鍵斷裂，因此在產(chǎn)物中容易生成無(wú)咪唑基的鈷啉醇酰胺類化合物，反應(yīng)不易控制。又因該反應(yīng)以鐵鹽做催化劑，對(duì)環(huán)境造成污染?；诙嗄昙租挵分苽涞慕?jīng)驗(yàn)與文獻(xiàn)資料[4]的查閱，選擇了兩種還原催化劑Por-A和Por-B、一種限制試劑QAS。該兩種催化劑都可迅速催化硼氫化鈉水解，而且都可以經(jīng)過(guò)再生后重復(fù)利用，不對(duì)環(huán)境造成固廢污染。因在反應(yīng)中加入了限制試劑，在還原過(guò)程中不會(huì)把氰鈷胺分子中的三價(jià)鈷還原成一價(jià)鈷。我們對(duì)以上兩種催化劑進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，由表2數(shù)據(jù)做出的甲鈷胺的轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的變化曲線見(jiàn)圖1。

表2 不同催化劑的轉(zhuǎn)化率 %

圖1 不同還原反應(yīng)催化劑的轉(zhuǎn)化率

由表2及圖1可以看出，催化劑Por-A的催化能力優(yōu)于催化劑Por-B，因此選擇催化劑Por-A作為該工藝的還原反應(yīng)催化劑，在30±2 ℃的溫度下，其最佳還原時(shí)間為20分鐘。

2.2 選擇新型甲基化試劑的原因和應(yīng)用效果

目前甲鈷胺的生產(chǎn)工藝中普遍采用的甲基化試劑是碘甲烷或三甲基碘化亞砜，碘甲烷是一種良好的親核試劑，但是碘甲烷的沸點(diǎn)只有42 ℃，揮發(fā)性極強(qiáng)，而且毒性也很大，因此這種工藝用料對(duì)操作人員的健康與生命極具威脅。尤其它不溶于水還要用甲醇或者乙醇作溶劑，為此在精制前還通過(guò)蒸發(fā)的方式除去溶劑，這一過(guò)程又會(huì)使甲鈷胺受熱破壞，從而降低收率并使產(chǎn)品質(zhì)量下降。雖然三甲基碘化亞砜無(wú)毒又溶于水，但它甲基化后會(huì)生成具有惡臭的硫醇類物質(zhì)隨著尾氣逸出到空氣中，這又造成了大氣污染。為此課題組根據(jù)文獻(xiàn)[5,6]及生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，選擇了一種全新的甲基化試劑M-S，該種試劑是一種固體、無(wú)毒無(wú)味、易溶于水，且甲基化后不產(chǎn)生異味物質(zhì)。經(jīng)試驗(yàn)證明其甲基化效果良好，可以使反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達(dá)99%以上，新型甲基化試劑與三甲基碘化亞砜的對(duì)比效果見(jiàn)表3。

表3 新型甲基化試劑與三甲基碘化亞砜的對(duì)比效果

根據(jù)表3的數(shù)據(jù)可知新型甲基化試劑M-S在同樣條件下能夠達(dá)到三甲基碘化亞砜的效果，同時(shí)減少了廢氣的排放。

2.3 反應(yīng)溫度、原料濃度及限制試劑加量反應(yīng)時(shí)間對(duì)甲鈷胺轉(zhuǎn)化率的影響

在確定催化劑Por-A、限制試劑QAS和甲基化試劑M-S后，我們以原有的工藝條件為基礎(chǔ)對(duì)其工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)分析[7]我們認(rèn)為反應(yīng)溫度、氰鈷胺投料濃度及限制試劑的加量將是影響甲鈷胺轉(zhuǎn)化率的主要因素。如果反應(yīng)溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)過(guò)于劇烈，使VB12分子降解，影響產(chǎn)品質(zhì)量和收率；如果反應(yīng)溫度過(guò)低，導(dǎo)致還原及甲基化反應(yīng)不完全，同樣影響產(chǎn)品的質(zhì)量與收率。在該反應(yīng)中，還原劑水解速度的限制試劑加量也同樣是一個(gè)重要參數(shù)，因此我們以反應(yīng)溫度、原料濃度及限制試劑的加量為影響因素，以正交試驗(yàn)法來(lái)獲得最佳反應(yīng)條件(以甲鈷胺的轉(zhuǎn)化率為目標(biāo)函數(shù))。試驗(yàn)方案的因素水平見(jiàn)表4。

表4 因素水平表

按照正交試驗(yàn)方案進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析以確定最佳反應(yīng)條件，方差分析表見(jiàn)表6。

表6數(shù)據(jù)可以看出： FA=57.02， FB=22.50大于F0.90(2,2)=9.0，也大于F0.95(2,2)=19.0，因此反應(yīng)溫度與甲基化時(shí)間兩因子在顯著性水平0.10與0.05上都是顯著的。而FC=2.47小于F0.9(2,2)=9.0，故物料濃度不顯著，可忽略。

表5 反應(yīng)溫度、原料濃度及甲基化時(shí)間的影響

表6 方差分析表

表5、表6的計(jì)算結(jié)果顯示： A3水平為最佳溫度條件，即40±2 ℃。B3水平為最佳甲基化反應(yīng)時(shí)間。對(duì)于不顯著物料濃度項(xiàng)，參考原有氰鈷胺的投料濃度，以2%為本研究的投料濃度。

正交試驗(yàn)完成后，以選取的工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證數(shù)據(jù)見(jiàn)表7。

表7 三批甲鈷胺數(shù)據(jù)

從表7數(shù)據(jù)可以看出：以正交實(shí)驗(yàn)確定的工藝條件可以實(shí)現(xiàn)甲鈷胺的高轉(zhuǎn)化率。把該條件作為甲鈷胺的合成條件。

2.4 甲鈷胺精制介質(zhì)的選取

現(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)要求原料藥的色普純度較高[8]，對(duì)于維生素B12品種來(lái)說(shuō)國(guó)際上一般要求其相關(guān)物質(zhì)以高效液相色譜法檢測(cè)不得大于2.0%。我們?yōu)榱耸沟眉租挵吩纤幵趪?guó)際上更具有競(jìng)爭(zhēng)力，將目標(biāo)定為相關(guān)物質(zhì)控制在1.0%以內(nèi)。為此課題組與介質(zhì)生產(chǎn)廠家合作生產(chǎn)了5種精制介質(zhì)：JZ-1、JZ-2、JZ-3、JZ-4、JZ-5。對(duì)5種介質(zhì)的精制性能進(jìn)行了試驗(yàn)研究。試驗(yàn)結(jié)果如表8。

表8 精制介質(zhì)的分離效果

注：表中分離效果是指在精制介質(zhì)上雜質(zhì)色帶與主色帶的分離程度。

從表8看出，精制介質(zhì)ZJ-3分離相關(guān)物質(zhì)的能力最好。

3 質(zhì)量研究

按照國(guó)內(nèi)外相關(guān)法律法規(guī)對(duì)新工藝所生產(chǎn)的產(chǎn)品進(jìn)行了穩(wěn)定性考察[9]與質(zhì)量研究。結(jié)果表明：新工藝生產(chǎn)的甲鈷胺產(chǎn)品的各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)均符合內(nèi)定的質(zhì)量指標(biāo)要求。

3.1 各國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)及產(chǎn)品內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)[10](表9～表12)

表9 國(guó)內(nèi)市場(chǎng)標(biāo)準(zhǔn)(CP)

表10 日本市場(chǎng)標(biāo)準(zhǔn)(JP)

表11 印度等市場(chǎng)標(biāo)準(zhǔn)(JP)

表12 美國(guó)市場(chǎng)標(biāo)準(zhǔn)(USP)

3.2 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單確認(rèn)

把以本課題研究確定的制備工藝制得的甲鈷胺與甲鈷胺標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行紅外光譜確認(rèn)，以溴化鉀壓片法制備測(cè)試樣品。

結(jié)論：甲鈷胺樣品的紅外圖譜與甲鈷胺標(biāo)準(zhǔn)品的紅外圖譜基本一致。故從其紅外光譜上可以證明以新工藝制備出的產(chǎn)品為甲鈷胺。結(jié)果表明：

(1)新工藝生產(chǎn)的甲鈷胺產(chǎn)品的各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)均符合內(nèi)定的質(zhì)量指標(biāo)要求；

(2)與工藝開(kāi)發(fā)前的產(chǎn)品對(duì)比研究表明，新工藝生產(chǎn)的甲鈷胺純度高，質(zhì)量明顯優(yōu)于工藝開(kāi)發(fā)前的產(chǎn)品；

(3)在已完成的加速穩(wěn)定性考察過(guò)程中，產(chǎn)品重點(diǎn)質(zhì)量指標(biāo)均符合各相關(guān)藥典規(guī)定。

4 結(jié)果與討論

本工藝研究取得的主要成果與結(jié)論簡(jiǎn)述如下：

(1) 提高了還原反應(yīng)轉(zhuǎn)化率：本課題確定了新型催化劑及還原反應(yīng)的工藝條件，該研究采用兩種不同的還原反應(yīng)催化劑，經(jīng)過(guò)大量的對(duì)比試驗(yàn)，選出了適合甲鈷胺合成反應(yīng)中還原工序適宜的催化劑及相應(yīng)的工藝條件，有效控制了還原劑的還原速度，使得氰鈷胺能夠快速生成二價(jià)態(tài)的B12。

(2) 滿足了清潔生產(chǎn)的要求：由于在還原反應(yīng)階段使用了新型催化劑，由于該催化劑能夠重復(fù)利用，在提倡可持續(xù)發(fā)展的今天，減少了原料藥生產(chǎn)中三廢的產(chǎn)生，有效的滿足了清潔生產(chǎn)的要求。

(3) 提高產(chǎn)品品質(zhì)，降低三廢：本課題選取了新的甲基化試劑，該甲基化試劑具有溶于水、甲基化能力強(qiáng)、不產(chǎn)生異味物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，不僅可以生產(chǎn)出滿足內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)品，同時(shí)對(duì)員工身體健康、環(huán)境保護(hù)做出了貢獻(xiàn)。

總之，以本課題研發(fā)的生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的甲鈷胺原料藥具有收率高、質(zhì)量好、成本低、清潔污染少等優(yōu)點(diǎn)。在滿足患者臨床用藥安全性、提高公司市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力方面具有重大意義。