， ， ， ，

(1.貴州農(nóng)業(yè)職業(yè)學院， 清鎮(zhèn) 551400； 2.貴州省旱糧研究所， 貴陽 550006；3.貴州省農(nóng)業(yè)科學院， 貴陽 550006)

藍粒小麥是長穗偃麥草(AgropyronelongatumL.，10 x=70)與普通小麥(Triticumaestivum, 6 x=42)復(fù)合雜交后代中選育出來的優(yōu)良品種，是擴展和補充普通小麥遺傳多樣性的重要種質(zhì)資源，其外形與普通小麥相同，染色體為42條，種子的胚乳呈藍色，藍色胚乳性狀的相關(guān)基因存在于代換到小麥中的一條長穗偃麥草染色體上[1-2]。藍粒小麥具有許多普通小麥沒有的優(yōu)良抗逆性狀，如成熟期落黃好，抗穗發(fā)芽能力強，高抗白粉病、條銹病，中抗葉銹等，同時含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、花青素和硒、鐵、鋅、鈣、碘等微量元素，營養(yǎng)價值較高，具有重要的保健作用，在改良小麥的抗性、提高品質(zhì)方面具有重要的利用價值[3-6]。

開展藍粒優(yōu)質(zhì)小麥遺傳改良研究是我國特色小麥種質(zhì)創(chuàng)新的重要嘗試。貴州省旱糧研究所將引種的藍粒小麥資源——貴陽綠麥進行了改良選育，現(xiàn)擁有91份藍粒小麥中間材料，于2001年用貴陽綠麥作母本與父本自育組合9988 F2進行有性雜交，通過貴陽、興義、昆明等地穿梭選育，成功育成二體代換系黔綠麥1號。本研究通過田間農(nóng)藝性狀調(diào)查、品質(zhì)、礦物質(zhì)檢測，雜交組合配制，SDS-PAGE及SSR分子標記技術(shù)，對育種衍生材料進行改良和選育，以篩選出穩(wěn)定的藍色小麥新品系供生產(chǎn)利用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用材料為藍粒小麥衍生后代，由貴州省農(nóng)業(yè)科學研究院旱糧研究所引種，并重組獲得，在該所小麥試驗地種植。

1.2 實驗方法

1.2.1 農(nóng)藝性狀調(diào)查、品質(zhì)及礦物質(zhì)檢測

調(diào)查株高、穗長、穗粒數(shù)、芒長、莖干彈性、生育期、千粒重等指標，每個株系3個重復(fù)。粗蛋白(干基)、濕面筋含量(14%濕基)、沉淀指數(shù)(14%濕基)、穩(wěn)定時間、面條評分、小圓餅干擴展系數(shù)、鈣、鐵、鋅、硒。

1.2.2 雜交組合配制

以黔綠麥1號為母本，以普通小麥05中27，黔9504，綿陽2002，夏繁22為父本配制的4個組合，以黔綠麥1號為父本，普通小麥05中27，黔9504，綿陽2002，夏繁22為母本配制的反交組合4個。

1.2.3 SSR標記

1) DNA的提取。利用特異標記Xgwm 165對雜交組合的F2代共494個單株進行了標記檢測，藍粒單株葉片DNA提取采用改良的CTAB法[7]。

2) PCR擴增。PCR反應(yīng)采用10μL體系(表1)，PCR擴增反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。PCR完成后，10μL反應(yīng)體系中加入6×上樣緩沖液2μL，混合均勻。電泳采用8%的非變性的聚丙烯酰胺凝膠，銀染法檢測。顯影后，在白熾燈下觀察電泳結(jié)果，進行條帶統(tǒng)計和照相(統(tǒng)計500 bp以下的片段， 片段大小是以100 bp DNA Ladder為標準判斷)。

1.2.4 SDS-PAGE

分析了衍生材料的高分子量麥谷蛋白亞基組成。種子高分子量谷蛋白(HMW-GS)的提取參考Marchylo[8]和Sutton的方法[9]。SDS-PAGE電泳分析參照Gupta[10]的方法。

表1 PCR反應(yīng)體系

貯存液終濃度10×buffer(含500mM KCl)1×1μL25mMMgCl21.5mM0.6μL10mMdNTP200μM0.2μL5μM primer F350nM0.7μL5μM primer R350nM0.7μL50ng/μL DNA模板5ng/μL1μL2.5U/μL Taq DNA聚合酶0.05U/μL0.2μLddH2O—5.6μL共計10μL

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)藝性狀調(diào)查及品質(zhì)和礦物質(zhì)檢測

黔綠麥1號屬弱冬性小麥品種，長芒，白殼，綠色籽粒，株高81 cm，穗長8.4 cm，穗粒數(shù)53粒/穗，莖稈彈性好，抗倒伏，生育期偏晚，千粒重39 g，15萬/667 m2基本苗情況下穗數(shù)可達27萬/667 m2。分蘗力強，葉色濃綠，分蘗期葉片上沖，抽穗期旗葉半披散，成熟期落黃好，籽粒半硬質(zhì)，抗穗發(fā)芽能力強。高抗白粉病、條銹病，中抗葉銹病，適宜在貴州省內(nèi)貴陽、畢節(jié)、遵義等地種植。

圖1 種植于田間的黔綠麥1號

鈣含量0.242 mg/kg，比普通小麥粉鈣含量增加60%；鐵含量102.5 mg/kg，較普通小麥粉鐵含量高出2.05倍；鋅含量49.175 mg/kg，較普通小麥粉鋅含量高出2.73倍；硒含量0.204 mg/kg，較普通小麥粉硒含量高出20倍，比中普綠麥1號增加25%(貴州大學農(nóng)產(chǎn)品食品質(zhì)量安全檢測中心檢測)。

粗蛋白(干基)含量為16.15%，濕面筋含量(14%濕基)34.8%，沉淀指數(shù)(14%濕基)60.7 mL，穩(wěn)定時間2.9 min，面條評分86.6分，小圓餅干擴展系數(shù)66，屬優(yōu)質(zhì)中筋小麥，適合制作面條、糕點等食品(農(nóng)業(yè)部谷物品質(zhì)檢驗中心檢測)。

注：Marker為100 bp DNA Ladder，C為CN 04-1；J為貴陽綠麥；1～36為F2群體里藍粒單株，目標條帶位置為170 bp左右。圖3 Xgwm 165 PCR檢測結(jié)果

注：從左到右依次為 ：藍粒小麥衍生后代0147/05中27 F3代 25份材料圖4 高分子量谷蛋白亞基組成

2.2 雜交組合配置

2.2.1 F1代植株上藍、黃粒種子粒數(shù)比例

以黔綠麥1號為母本的4個雜交組合，F(xiàn)1代植株上黃、藍粒數(shù)的比例為(77～99)∶100，平均為87.5∶100，即黃粒占總粒數(shù)的46.6%；而以黔綠麥1號作父本時，F(xiàn)1代植株上黃、藍粒數(shù)的比例為(75～90)∶100，平均為86.8∶100，即黃粒占總粒數(shù)的46.5 %(表2)。

表2 F1代植株上藍黃粒比例

雜交組合總粒數(shù)黃粒數(shù)藍粒數(shù)黃藍粒比例黔綠麥1號×05中2759432962298199∶10005中27×黔綠麥1號117753464383∶100黔綠麥1號×綿陽2002117095083662677∶100綿陽2002×黔綠麥1號24221136128688∶100黔綠麥1號×夏繁2244732159231493∶100夏繁22×黔綠麥1號2176931124575∶100黔綠麥1號×黔950452502574267696∶100黔9504×黔綠麥1號82683926434290∶100

圖2 F2單株籽粒顏色分離

2.2.2 F2代植株上黃、藍粒分離情況

以F2代種子分黃、藍粒成對種植的株行中選擇單株，在黃粒行中選出20個單株，在藍粒行中選出28個單株。結(jié)果表明：在黃粒行中有13個單株穗上的種子全為黃粒，有7個單株穗上的種子有極少數(shù)的藍粒種子，藍、黃粒的比例為(0.77～3.85)∶100，平均為1.98∶100(表3)。

當選的來自藍粒行的28株F2代植株，再根據(jù)組合來源分別加以分析，結(jié)果見表4。以黔綠麥1號作父本的3個雜交組合，種色仍有分離，中選藍粒單株分別為05中27×黔綠麥1號組合5株，綿陽2002×黔綠麥1號組合13株，夏繁22×黔綠麥1號組合10株。3個組合的F2代植株上黃、藍粒種子數(shù)的比例為(64～88)∶100，平均為73.7∶100，即黃粒占總粒數(shù)的42.4 %(表3、表4)，這比上一代的46.5%略有降低。

2.2.3 藍粒小麥對普通小麥在田間自然授粉異交情況

藍粒小麥與普通小麥田間自然授粉的異交情況，以藍粒小麥的種子藍色作為標記基因，可以在不去雄的情況下，進行自然授粉，普通小麥穗上有藍色種子，藍粒小麥穗上有黃粒種子，即為藍粒小麥與普通小麥的異交種。從試驗結(jié)果看出，6個普通小麥品種，每小區(qū)種植2～4行，小區(qū)收獲混合脫粒后，帶有藍色種子的粒數(shù)為20～68粒，自然異交率為1.26%～5.15%，平均為2.66%。

2.3 SSR標記

對綠麥雜交組合的F2代共494個單株進行了標記檢測(圖3)，在后代材料的檢測中，由于播種時選取的均為藍粒，檢測結(jié)果除其中1株未擴增出目標條帶，其它493株均能擴增出270 bp目標條帶。

表3 F2代當選單株穗上藍黃粒分離情況

當選單株總株數(shù)全黃粒株藍黃粒株黃粒數(shù)藍粒數(shù)黃藍粒比例黃粒株20137417209881.98∶100藍粒株28028127111725673.7∶100

表4 F2代藍粒植株上藍黃粒比例

雜交組合株數(shù)總粒數(shù)黃粒數(shù)藍粒數(shù)黃藍粒比例05中27×黔綠麥1號532671533173488∶100綿陽2002×黔綠麥1號13132585932732681∶100夏繁22×黔綠麥1號10134425246819664∶100

表5 藍粒小麥衍生后代HMW-GS組成

材料Glu-A1Glu-B1Glu-D1材料份數(shù)Null202+12251202+125172+122Null72+1280147/05中27F3Null13+192+127113+192+123Null7+92+127172+121Null72+121205中27/0147F3Null202+1218Null13+192+121113+192+1211204+121Null202+12300147/9938F31202+12221202+12109938/0147F3Null202+121217+92+1210147/9988-43F3Null202+12271202+12209988-43/0147F3Null202+1214Null202+12131202+123Null205+107Null75+104Null7+92+1210147/MY2002-2F3Null72+4+121Null13+195+103Null7+82+121Null13+192+121Null14+155+101172+121Null72+121Null72+122Null7+92+125Null202+125MY2002-2/0147F3Null202+5+102Null13+195+107Null205+107Null75+1041202+1221202+12190147/夏繁22F3Null202+1230Null202+1232夏繁22/0147F3Null222+1231202+1212

2.4 SDS-PAGE分析藍粒小麥衍生后代HMW-GS組成及等位變異

Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1位點上上的等位變異分別為2、6、5種，3個位點上的優(yōu)勢亞基分別是Null(占80.44%)，20，13+19(占87.88%)，6,33%，2+12(占89.81%)。在Glu位點共檢測到18種亞基組合，組合(Null、20、2+12)為優(yōu)勢亞基組合。這些藍粒小麥衍生后代可作為改良小麥品質(zhì)性狀的重要遺傳資源。

3 討 論

Xgwm 165在親本CN 04-1和貴陽綠麥之間具有多態(tài)性，利用Xgwm 165來驗證F2群體中的494個藍粒單株，僅1株未擴增出目標條帶，說明270 bp條帶與藍?；蚓o密連鎖，交換率僅為1/494。據(jù)此推論貴陽綠麥和魏利青[11]研究的烏麥526的藍?；蚩赡転橥粊碓?。Xgwm 165擴增出的條帶差異明顯，準確率高，可以用作貴陽綠麥組合后代藍?；虻淖粉欉x擇。

藍粒小麥衍生后代材料的高分子量谷蛋白亞基中變異相對偏少，亞基組合為18種類型，Null、20、2+12為優(yōu)勢亞基。Glu-D1位點上5+10亞基對小麥加質(zhì)效應(yīng)明顯被稱為優(yōu)質(zhì)亞基，提高5+10等優(yōu)質(zhì)亞基的頻率是改善我國小麥品質(zhì)的重要措施，可見，藍粒小麥在品質(zhì)上有很大的提升空間，育種時可與優(yōu)質(zhì)親本相互組配，從雜交后代中選擇具有雙親的優(yōu)質(zhì)亞基的高分子量麥谷蛋白亞基組合，進而提高藍粒小麥的面包烘烤品質(zhì)。