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(陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心， 陜西 咸陽 712083)

丹參(SalviaemiltiorrhizaeBunge)又稱紅根，系唇形科(Lamiaceae)鼠尾草屬(Salvia)多年生草本植物，在我國山東、陜西、四川等省份有廣泛栽培，其干燥根為《中華人民共和國藥典》收載中藥丹參的唯一來源[1-3]。丹參具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰等功效，現(xiàn)主要為栽培藥材，隨著制藥工業(yè)上對丹參藥材需求量不斷增加，其種植面積也不斷擴大[3]。陜西地區(qū)自古就有種植丹參的傳統(tǒng)，為丹參的道地性產(chǎn)區(qū)之一，陜西“商洛丹參”同時也是國家地理標志保護產(chǎn)品[5]。目前陜西地區(qū)多采取育苗移栽的方式種植丹參，通常在第1年6—7月間播種育苗，10—11月初或第2年春季移栽。丹參播種時正值夏季，氣候炎熱、地表溫度高，受干旱影響而導(dǎo)致出苗率低、幼苗生長緩慢是目前該地區(qū)丹參種植面臨的主要問題之一[6]。

種子包衣技術(shù)是提高種子質(zhì)量、促進種子產(chǎn)業(yè)化標準化、預(yù)防病蟲害的一項先進技術(shù)[7]。通過助劑和成膜劑可將生長調(diào)節(jié)劑、農(nóng)藥、微肥等包裹在種子表面并固化成種衣，使各種活性物質(zhì)緩慢釋放，起到調(diào)節(jié)植物生長，防病治蟲和提高植物抗逆性等作用[8-9]。目前，在胡麻、甘草和黃芪等藥用植物上均有應(yīng)用種子包衣劑處理防治病蟲害的報道[10-12]。針對目前陜西地區(qū)丹參在播種育苗階段所存在的問題，本研究擬利用前期自研制的懸浮種衣劑包衣丹參種子，在模擬干旱處理的情況下，通過對種子萌發(fā)特性、幼苗生長和相關(guān)抗氧化保護酶活性進行檢測，分析種衣劑對丹參生長發(fā)育和抗干旱的影響，以期為提高丹參育苗效率提供科學(xué)的方法。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

供試的丹參種子由陜西天士力植物藥業(yè)有限責任公司提供，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)李鉑博士鑒定為丹參(SalviaemiltiorrhizaeBunge)的干燥成熟種子。

1.2 主要試劑

種子處理所用試劑為自研制的懸浮種衣劑[8]，其有效成分(按質(zhì)量分數(shù)折百)為0.005%赤霉素GA3，0.003%水楊酸，0.001%復(fù)硝酚鈉，0.001%DA-6(胺鮮酯)，5%平衡肥(含大量元素和微量元素)。分別稱取一定量的原藥、潤濕劑、分散劑、增稠劑，以0.5%堿性品紅作為警戒色，將各組分加入高剪切混合乳化機于25 ℃剪切混合0.5 h。隨后在混合液中加入一定量的成膜劑于分散砂磨機(介質(zhì)為鋯珠，介質(zhì)系數(shù)為1)中研磨3 h，制成種子包衣劑。

1.3 實驗設(shè)計

選取飽滿健壯、大小一致的丹參種子，按包衣比[包衣劑質(zhì)量(g)∶種子質(zhì)量(g)]1∶50分別置于封口袋中均勻混合，晾干后備用。種子萌發(fā)與苗期實驗分別在培養(yǎng)皿和苗盤中，于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)進行。按照張春平等[13]的方法，將未包衣和包衣后的種子放入鋪有2層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，以清水和20% PEG-6000溶液處理各種子，共設(shè)置4種處理： 1) 清水+未包衣種子， 2) 清水+包衣種子， 3) PEG+未包衣種子， 4) PEG+包衣種子。每個培養(yǎng)皿50粒種子，重復(fù)5次，光照與黑暗時間設(shè)為12 h/12 h，光照強度為2 000 lx，在培養(yǎng)箱中進行(25±1)/(15±1)℃的變溫培養(yǎng)

1.4 實驗方法

1.4.1 種子萌發(fā)特性指標測定

連續(xù)培養(yǎng)觀察 10 d，每天定時統(tǒng)計種子萌發(fā)數(shù)，在第10天計算種子發(fā)芽率，在第5天計算發(fā)芽勢，在第30天結(jié)合幼苗根長計算簡化活力指數(shù)。

種子發(fā)芽率(%)=10 d發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%；

發(fā)芽勢(%)=5 d發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%；

簡化活力指數(shù)=種子發(fā)芽率×根長。

1.4.2 幼苗生長和生理特性指標測定

將種子按每盤50粒分別撒播種植于育苗盤中，育苗盤中介質(zhì)為沙土(V/V=1∶1)，每種處理設(shè)3個重復(fù)，每5 d用噴壺澆清水或20% PEG-6000 1次，按照1.3的培養(yǎng)條件于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d，培養(yǎng)結(jié)束后每組處理選10株幼苗，分別測量其根長、株高和干重等指標，幼苗活力指數(shù)的計算參照黃文靜等[13]的方法。

參照張憲政[14]的混合浸取法，以等體積混合的丙酮無水乙醇混合液浸提葉片，分光光度計測定663,645,470 nm處吸光值計算葉片中葉綠素和類胡蘿卜素含量。采用磺基水楊酸提取脯氨酸，并用茚三酮法測定其含量，MDA 的測定采用硫代巴比妥酸(TBA)雙組分光光度法，以μmol/g表示MDA的量[15]。

1.4.3 抗氧化保護酶活性測定[16]

超氧化物歧化酶(SOD) 活性的測定采用氮藍四唑(NBT)還原法，以U/(g·h)表示。過氧化物酶(POD)活性的測定以愈創(chuàng)木酚法進行測量，以每分鐘A值減小0.01定義為1個酶活力單位[U/(g·min)]。過氧化氫酶(CAT)活性的測定采用紫外吸收法測定，以每分鐘A值減少0.1定義為1個酶活力單位[U/(g·min)]。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)用Excel軟件處理作圖，并采用SPSS 19.0軟件進行差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種衣劑和干旱處理對丹參種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

由表1可知，未包衣種子在正常狀態(tài)下(清水處理)的發(fā)芽率為52%左右，20% PEG-6000模擬干旱處理使丹參種子發(fā)芽率降低至30%；種衣劑包衣能夠明顯提高丹參種子發(fā)芽率，分別比正常狀態(tài)下和干旱脅迫下的未包衣種子高出28.24%和118.95%；包衣種子在干旱情況下仍能保持40%左右的發(fā)芽率，可見種衣劑包衣在一定程度上增強了種子的抗旱性。各處理間種子發(fā)芽勢和簡化活力指數(shù)的總體趨勢與發(fā)芽率一致，表現(xiàn)為：清水+包衣種子>清水+未包衣種子>PEG+包衣種子>PEG+未包衣種子。除能夠顯著提高發(fā)芽率外，種衣劑包衣能夠顯著促進丹參幼苗生長，種衣劑包衣后的丹參幼苗根長、株高和單株干重均為各處理中最大值；干旱情況下丹參包衣種子的幼苗在根長和株高上大于未包衣種子的幼苗。

表1 種衣劑和干旱處理對丹參種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

處理發(fā)芽率(%)發(fā)芽勢(%)根長(cm)株高(cm)單株干重(g)簡化活力指數(shù)清水+未包衣種子52.40±4.15b39.80±3.34b3.60±0.35a5.22±0.36b0.188±0.010b1.89±0.26b清水+包衣種子67.20±3.56a56.40±3.04a4.00±0.36a5.90±0.33a0.206±0.010a2.68±0.30aPEG+未包衣種子30.60±6.76d13.60±3.36d2.48±0.37c4.06±0.35d0.165±0.005c0.76±0.23dPEG+包衣種子40.80±2.16c23.80±3.27c2.98±0.31b4.68±0.28c0.176±0.005c1.22±0.18c

注：不同的小寫字母代表5%的顯著性。下同。

表2 種衣劑和干旱處理對丹參幼苗生理指標的影響

處理葉綠素a+b(mg/g)葉綠素a/b類胡蘿卜素(mg/g)MDA(mg/g)脯氨酸(μg/g)清水+未包衣種子1.255±0.052b3.041±0.048b0.058±0.002b0.280±0.012a43.87±2.24b清水+包衣種子1.456±0.074a2.836±0.034d0.068±0.002a0.254±0.004b54.38±2.43aPEG+未包衣種子1.028±0.023c3.137±0.043a0.043±0.003d0.282±0.006a37.13±3.98cPEG+包衣種子1.312±0.045b2.893±0.030c0.050±0.002c0.276±0.006a42.48±1.67b

2.2 種衣劑和干旱處理對丹參幼苗生理指標的影響

葉綠素是植物進行光合作用的重要色素，干旱脅迫會使植物的葉綠素含量降低，從而減弱光合作用，減少干物質(zhì)合成。由表2可知，種衣劑包衣能夠顯著提高丹參幼苗葉片中的葉綠素和類胡蘿卜素含量；干旱脅迫使2種光合色素的含量降低，而種子包衣能夠在一定程度上抑制干旱引起的光合色素降解，比干旱情況下未包衣種子幼苗的葉綠素和類胡蘿卜素分別高出27.45%和16.28%。MDA為膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，其含量在一定程度上反映了細胞受到傷害的程度。通過檢測各處理下丹參幼苗MDA含量發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下未包衣種子幼苗中的MDA含量最高達0.282 mg/g，但與干旱下包衣種子和正常情況下未包衣種子幼苗中的MDA含量差異不顯著，而正常情況下包衣種子幼苗中的MDA含量最低，且與其他處理的差異達顯著水平。脯氨酸是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，多數(shù)研究認為其含量高低與植物的抗逆性呈正相關(guān)關(guān)系，通過檢測發(fā)現(xiàn)，正常情況下包衣種子幼苗中的脯氨酸含量最高，包衣劑能夠顯著提高丹參幼苗脯氨酸含量，干旱條件下包衣種子幼苗中脯氨酸含量是未包衣種子的1.14倍，兩者差異顯著。

2.3 種衣劑和干旱處理對丹參抗氧化保護酶活性的影響

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)是植物對逆境脅迫反應(yīng)的“晴雨表”，同時對于清除活性氧自由基、維持細胞膜的穩(wěn)定性和完整性，提高植物抗逆性起著關(guān)鍵的作用。通過圖1～圖3可知，各處理下SOD、CAT和POD的總體趨勢基本一致，表現(xiàn)為：清水+包衣種子>清水+未包衣種子>PEG+包衣種子>PEG+未包衣種子。正常情況下未包衣種子幼苗與干旱處理下包衣種子幼苗間的SOD以及CAT活性差異不顯著(圖1、圖2)，這也從側(cè)面反映了包衣劑能夠在一定程度上提高干旱脅迫下丹參幼苗中抗氧化保護酶的活性，結(jié)合種子萌發(fā)特性和各處理下丹參幼苗的生長情況，可以明顯看出種衣劑包衣增強了種子和幼苗的抗旱性，促進了丹參幼苗的生長。

圖1 種衣劑和干旱處理對丹參SOD活性的影響

圖2 種衣劑和干旱處理對丹參CAT活性的影響

圖3 種衣劑和干旱處理對丹參POD活性的影響

3 結(jié)論和討論

丹參大田育苗關(guān)鍵要解決“出得來”和“長得好”2個問題，高萌發(fā)率的種子和健壯的幼苗是今后進行移栽并保證藥材產(chǎn)量和質(zhì)量的基礎(chǔ)。目前，陜西乃至整個西北地區(qū)的丹參播種育苗基本在麥收后進行，此時天氣晴朗、氣溫較高，種子出芽和種苗生長易受干旱影響。通過前期研究，本課題組開發(fā)出針對這一問題的丹參種子專用包衣劑，該種子包衣劑活性成分為一定數(shù)量和種類的植物生長調(diào)節(jié)劑和微肥，此外種衣劑助劑有一定的保水和緩釋功能。本次試驗發(fā)現(xiàn)，通過包衣劑包衣后的丹參種子出芽率明顯高于未包衣種子，在模擬干旱條件下包衣種子仍能保持40%的高出芽率，其種子發(fā)芽勢、幼苗株高和根長也大于干旱條件下未包衣種子，說明種衣劑能夠促進種子萌發(fā)和幼苗的生長，并在一定程度上增強了種苗的抗逆性。

通過對丹參幼苗相關(guān)生理指標進行檢測發(fā)現(xiàn)，種衣劑包衣顯著提高了幼苗總?cè)~綠素和類胡籮卜素含量并降低了葉綠素a/b值，有研究表明，單位質(zhì)量的葉片中較高的總?cè)~綠素含量和較低的葉綠素a/b能夠表明樣品葉綠體中光系統(tǒng)Ⅱ捕光復(fù)合體(LHCⅡ)含量多，這有利于植株吸收其生長環(huán)境中的有限光能；而類胡蘿卜素可以耗散葉綠素吸收的過多光能，使葉綠素不致因光氧化而遭破壞[17-18]。逆境脅迫引起活性氧升高導(dǎo)致了植物細胞膜系統(tǒng)的過氧化，而MDA則是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物；脯氨酸作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì), 與蛋白質(zhì)相互作用可增加蛋白質(zhì)可溶性和減少可溶性蛋白的沉淀，從而保持細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性[5,19]。因此逆境脅迫下低MDA和高脯氨酸含量通常被認為是植物抗逆性增強的表現(xiàn)。本次研究發(fā)現(xiàn)，通過模擬干旱處理后丹參幼苗MDA含量略微升高，而脯氨酸含量則顯著降低，結(jié)合種子出芽率的降低和幼苗生長受到的抑制，說明使用20% PEG-6000模擬干旱處理達到了理想的脅迫效果；而種子包衣劑處理能夠抑制脅迫引起的脯氨酸含量降低，并使其保持在一個較高水平。

逆境脅迫通常導(dǎo)致細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與清除平衡遭到破壞而出現(xiàn)活性氧的積累，從而影響細胞膜功能和植物的正常生長[19]；而植物體為了降低活性氧的毒害作用，其自身形成了活性氧清除系統(tǒng)，SOD、POD和CAT便是該系統(tǒng)的重要組成成員[20]。本次研究發(fā)現(xiàn)，非脅迫條件下丹參幼苗中抗氧化保護酶活性遠高于脅迫條件下，種衣劑包衣能夠使丹參幼苗SOD、POD和CAT活性再次提升到一個更高水平，可為丹參幼苗抵御因干旱脅迫引起的過氧化傷害提供生理保護。綜上所述，丹參種子包衣后，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢和單株干重顯著提高，幼苗中抗氧化保護酶活性、葉綠素含量和脯氨酸含量升高，丹參幼苗生長速度加快，對干旱的抗性得以增強。