李成洪，宋青龍，王曉中，唐 達(dá)，傅 巍，楊春柳

(1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460，2.北京龍科方舟生物工程技術(shù)有限公司，北京 100193； 3.國家飼料工程技術(shù)研究中心，北京 100193)

豬瘟是由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種急性、發(fā)熱、具有高度傳染性的疫病，在自然條件下只感染豬，不同年齡、性別、品種的豬和野豬都易感，一年四季均可發(fā)生，且病死率高，傳播迅速，蔓延地區(qū)廣，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成了極大威脅。本病在1833年首次發(fā)現(xiàn)于美國，之后其流行遍及全球，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。20世紀(jì)50年代，我國豬瘟兔化弱毒疫苗問世后，對(duì)豬瘟的控制主要依賴于疫苗免疫，因此，疫苗免疫效果的優(yōu)劣對(duì)豬瘟防控起了決定性作用，而豬瘟抗體水平的監(jiān)測是疫苗免疫效果評(píng)價(jià)的主要方法[2]。目前市場上檢測豬瘟抗體的產(chǎn)品主要是進(jìn)口的ELISA試劑盒[3]，但其價(jià)格昂貴，需要專業(yè)人員操作，且檢測時(shí)間長[4]。而現(xiàn)有的豬瘟抗體膠體金及熒光免疫層析檢測卡，只能做定性檢測[5]，即根據(jù)T線的有無判定樣本中豬瘟抗體的陰陽性[6-8]。這種判定憑肉眼觀察[9-10]，主觀性較強(qiáng)，且結(jié)果對(duì)于疫苗免疫效價(jià)的評(píng)定意義不大。因此，應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)，結(jié)合膠體金定量讀數(shù)儀，進(jìn)行了快速定量豬瘟抗體檢測卡的研制，以期可快速定量檢測豬血清中豬瘟抗體水平。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 氯金酸(HAuCl4·4H2O)，國藥；豬瘟重組E2蛋白，北京龍科方舟生物工程技術(shù)有限公司；羊抗鼠IgG、小鼠IgG，上海金標(biāo)生物科技有限公司；硝酸纖維素膜，Millipore；膠體金結(jié)合墊、樣品墊、吸水紙，上海金標(biāo)生物科技有限公司；豬瘟病毒抗體檢測試劑盒(ELISA)，IDEXX；豬圓環(huán)病毒病陽性血清、豬偽狂犬病陽性血清、豬繁殖與呼吸綜合征陽性血清、豬乙型腦炎陽性血清、待檢血清，重慶市畜牧科學(xué)院。

1.1.2 儀器設(shè)備 三維平面點(diǎn)膜噴金儀HM3030，上海金標(biāo)生物科技有限公司；微電腦自動(dòng)斬切機(jī)ZQ2000，上海金標(biāo)生物科技有限公司；高速冷凍離心機(jī)H-2050R，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；紫外連續(xù)掃描分光光度計(jì)，Thermo；數(shù)顯磁力攪拌電熱套，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；手持式膠體金定量讀數(shù)儀，深圳元秦科技有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 膠體金溶液的制備 在圓底燒瓶中加入1 L超純水加熱至煮沸，加入10 mL 1%氯金酸溶液，2 min后加入12 mL 1%檸檬酸三鈉溶液，此時(shí)溶液顏色由黑色逐漸變?yōu)榫萍t色。繼續(xù)煮沸15 min后停止加熱，冷卻至室溫，4 ℃貯存。紫外掃描檢測膠體金溶液質(zhì)量。

1.2.2 抗原最佳標(biāo)記pH值的確定 取1 mL膠體金溶液，分別加入1、3、5、8、10、15、20 μL濃度為0.2 mol/L的碳酸鉀(K2CO3)溶液調(diào)節(jié)pH值[11]，豬瘟重組E2蛋白按照0.02 mg/mL標(biāo)記，終濃度1% BSA封閉，離心去上清液后用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌一次，再次離心后用150 μL懸浮液懸浮。小鼠IgG按照0.01 mg/mL標(biāo)記后，與標(biāo)記好的抗原等體積混勻?；旌弦喊?0 μL/cm噴金量包被在膠體金結(jié)合墊上，37 ℃干燥2 h。

豬瘟重組E2蛋白和羊抗鼠IgG分別稀釋到1.0 mg/mL，按1 μL/cm劃膜量包被到NC膜上，37 ℃干燥1 h。組裝大板、切條，用豬瘟病毒弱陽性血清檢測，觀察T線顯色情況，選擇沒有死金的且顯色最強(qiáng)的K2CO3溶液用量作為最佳標(biāo)記pH值。

1.2.3 抗原最佳標(biāo)記濃度與最佳包被濃度的確定

用確定的最佳標(biāo)記pH值，豬瘟重組E2蛋白分別按照0.01、0.02、0.03、0.04 mg/mL標(biāo)記，小鼠IgG按照0.01 mg/mL標(biāo)記。豬瘟重組E2蛋白分別按照0.2、0.4、0.8、1.0 mg/mL包被在T線位置，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，檢測豬瘟病毒陽性血清、弱陽性血清和陰性血清。選擇弱陽性血清顯色明顯且陽性血清與弱陽性血清顯色差異最大的組合為最佳條件。在此條件下，羊抗鼠IgG按照分別按照0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL包被在C線位置，檢測豬瘟病毒陽性血清，選擇C線顯色強(qiáng)度與T線相當(dāng)?shù)陌粷舛葹樽罴褩l件。

將包被有豬瘟重組E2蛋白和羊抗鼠IgG的硝酸纖維素膜、噴有豬瘟重組E2蛋白偶聯(lián)膠體金的聚酯墊、玻璃纖維濾紙與吸水紙組裝在PVC底板上，用切條機(jī)切成4.0 mm寬的試紙條，裝入檢測卡殼中，即為最終的檢測卡。

1.2.4 樣品檢測方法的確定 將豬瘟陽性血清、弱陽性血清、陰性血清分別取50、80、100、150 μL加到加樣孔中，室溫反應(yīng)10、13、15、20 min觀察結(jié)果，確定加樣量及反應(yīng)時(shí)間。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用豬瘟陰性血清按梯度稀釋陽性血清，用ELISA試劑盒檢測并計(jì)算其阻斷率，分別取80 μL加到檢測卡的加樣孔中，室溫反應(yīng)15 min，放入膠體金定量讀數(shù)儀中，讀取T線與C線的峰面積比值即T/C值，每個(gè)濃度重復(fù)檢測5次，計(jì)算平均值。以T/C值平均值為橫坐標(biāo)、血清樣本阻斷率為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 結(jié)果判定方法的建立 檢測卡檢測20份豬瘟抗體陰性血清，用定量讀數(shù)儀讀取T/C值，計(jì)算cutoff值。檢測臨床樣本的T/C值小于該值判定為陰性，大于該值同時(shí)小于阻斷率為40血清樣本對(duì)應(yīng)的T/C值為灰區(qū)，大于阻斷率為40血清樣本對(duì)應(yīng)的T/C值的樣本則以定量讀數(shù)儀結(jié)果為最終結(jié)果。

1.2.7 檢測卡特異性檢測 豬瘟檢測卡分別檢測豬圓環(huán)病毒病陽性血清、豬偽狂犬病陽性血清、豬繁殖與呼吸綜合征陽性血清、豬乙型腦炎陽性血清，確定本檢測卡的特異性。

1.2.8 檢測卡重復(fù)性及加速穩(wěn)定性檢測 檢測卡分別檢測豬瘟抗體陰性、弱陽性、陽性血清，每份血清樣本重復(fù)檢測5次，考察其重復(fù)性。將檢測卡放置于45 ℃溫箱中，分別于第0、2、4、6、8周檢測豬瘟抗體陰性、弱陽性、陽性血清，考察檢測卡的穩(wěn)定性。

1.2.9 樣本檢測 隨機(jī)選取71份豬血清樣本，分別用ELISA試劑盒和本檢測卡檢測豬瘟抗體水平，比較檢測結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠體金溶液掃描結(jié)果 以雙蒸水為對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)在400～700 nm連續(xù)掃描，測定吸收曲線和吸收峰，結(jié)果為：λmax=527 nm，ODmax=0.109。所制備的膠體金溶液顆粒大小在40 nm左右，顏色為透明的酒紅色，液面無油質(zhì)類漂浮物，可用于試紙條制備。

2.2 抗原最佳標(biāo)記pH值 膠體金中加入5 μL 0.2 mol/L K2CO3溶液調(diào)節(jié)pH值時(shí)，標(biāo)記抗原沒有死金現(xiàn)象，且顯色最強(qiáng)，調(diào)節(jié)后的膠體金溶液的pH值在8.0左右。

2.3 抗原最佳標(biāo)記濃度與最佳包被濃度 通過正交實(shí)驗(yàn)，確定豬瘟重組E2蛋白和小鼠IgG分別按0.01 mg/mL標(biāo)記、T線豬瘟重組E2蛋白按照0.8 mg/mL包被、C線羊抗鼠IgG按照1.0 mg/mL包被為最佳條件組合。

2.4 樣品檢測方法的確定 取血清樣本80 μL加到加樣孔中，室溫反應(yīng)10 min，為樣本的檢測條件。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 通過檢測梯度稀釋的陽性血清，確定線性范圍及對(duì)應(yīng)的T/C值。以T/C值平均值為橫坐標(biāo)、陽性樣本阻斷率為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

2.6 結(jié)果判定方法的建立 檢測卡檢測20份豬瘟抗體陰性血清，用定量讀數(shù)儀讀取T/C值，計(jì)算cutoff值為0.035。確定檢測臨床樣本的T/C值小于0.035判定為陰性，大于0.035同時(shí)小于0.331判定為灰區(qū)，大于0.331的則以定量讀數(shù)儀結(jié)果為最終結(jié)果。

2.7 檢測卡的特異性 本檢測卡檢測豬圓環(huán)病毒病陽性血清、豬偽狂犬病陽性血清、豬繁殖與呼吸綜合征陽性血清、豬乙型腦炎陽性血清，結(jié)果均為陰性(圖2)，說明檢測卡與以上疫病抗體無交叉反應(yīng)。

圖1 豬瘟抗體快速定量檢測卡標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 1 Standard curve of CSF rapid and quantitative test card

a.豬瘟陽性對(duì)照，CSF；b.豬圓環(huán)病毒病，PC；c.豬偽狂犬病，PR；d.豬繁殖與呼吸綜合征，PRRS；e.豬乙型腦炎，JE

2.8 檢測卡重復(fù)性結(jié)果 用同批次檢測卡分別檢測豬瘟抗體陰性、弱陽性、陽性血清，每個(gè)濃度重復(fù)檢測5次，批內(nèi)重復(fù)性結(jié)果見表1。結(jié)果表明，豬瘟抗體檢測卡的批內(nèi)重復(fù)性好，無明顯差異。

表1 檢測卡批內(nèi)重復(fù)性Tab 1 Intra repeatability of CSF rapid and quantitative test card

2.9 檢測卡加速穩(wěn)定性結(jié)果 將檢測卡放置于45 ℃溫箱中，于第0、2、4、6、8周檢測豬瘟抗體陰性、弱陽性、陽性血清，其穩(wěn)定性結(jié)果見表2?？梢钥闯觯瑱z測卡在45 ℃下保存8周其檢測結(jié)果無明顯差異，可依此確定檢測卡室溫保質(zhì)期最少為6個(gè)月。

2.10 樣品檢測結(jié)果 檢測卡和ELISA試劑盒檢測71份樣本中豬瘟抗體結(jié)果見表3。部分樣本具體對(duì)比結(jié)果見表4。

表2 檢測卡穩(wěn)定性Tab 2 Stability of CSF rapid and quantitative test card

表3 檢測卡與ELISA檢測豬瘟抗體結(jié)果符合情況Tab 3 The detected results of the test card and ELISA

表4 豬瘟抗體定量檢測卡檢測樣本結(jié)果Tab 4 Detection results of CSF rapid and quantitative test card

由表3可見，相對(duì)ELISA檢測法，定量檢測卡檢測陽性為40份，陰性為31份，假陽性為2份，假陰性為5份。定量檢測卡的靈敏度為88.4%，特異性為92.9%，總符合率為90.1%。

由表4可見，定量檢測卡檢測豬瘟抗體陽性樣本的阻斷率與ELISA結(jié)果有較好的符合度，相對(duì)誤差在15%以內(nèi)。

3 討 論

豬瘟是妨礙養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要疫病之一，在豬瘟的防疫中，豬瘟抗體水平的檢測是十分必要的，其高低反應(yīng)了豬對(duì)豬瘟病毒的抵抗能力及疫苗免疫效果。目前主要用ELISA試劑盒檢測豬瘟抗體水平，但其檢測時(shí)間通常需要1.5～3 h[12-13]。實(shí)驗(yàn)研制的膠體金定量檢測卡結(jié)合手持式定量讀數(shù)儀，其操作簡便、步驟單一，加樣80 μL后反應(yīng)只需10 min，即可讀取T/C值及對(duì)應(yīng)的阻斷率，避免了人為主觀判斷造成的差異，適用于單個(gè)及多個(gè)樣本的檢測。與ELISA結(jié)果相比，檢測卡靈敏度為88.4%，特異性為92.9%，總符合率為90.1%。檢測陽性樣本的阻斷率與ELISA結(jié)果的相對(duì)誤差在15%以內(nèi)，符合度較好。同時(shí)檢測卡只需常溫儲(chǔ)存，加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明45 ℃條件下8周其結(jié)果差異仍小于15%，相當(dāng)于常溫放置6個(gè)月。實(shí)驗(yàn)研制的豬瘟抗體快速定量檢測卡使用方便、快速，成本低，可用于豬瘟抗體的快速檢測，適合基層獸醫(yī)站和養(yǎng)殖企業(yè)使用。