范 娟，吳華偉，郎洪武，郝雪斌， 陳曉春，劉國英，高金源，趙麗霞，鄧 永，范秀麗

(1.揚州優(yōu)邦生物藥品有限公司，揚州，225008 ；2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京，100081；金宇保靈生物藥品有限公司，呼和浩特，010030)

牛病毒性腹瀉/黏膜病(Bovine viral diarrhea/Mucosal Disease，BVD/MD)是黃病毒科瘟病毒屬牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起的以發(fā)熱、粘膜糜爛潰瘍、白細胞減少、腹瀉、咳嗽及懷孕母牛流產或產出畸形胎兒為主要特征的一種傳染病[1-2]。目前，該病在世界范圍內廣泛流行。我國于1983年首次分離到了BVDV[3]。近年來，流行病學調查表明我國牛、羚羊、鹿、豬等均不同程度的感染BVDV[1,4,5]，該病已嚴重影響著我國畜牧業(yè)的健康發(fā)展。本研究從云南某牛場疑似感染BVDV病例的牛腫大出血的腸系膜淋巴結和脾臟樣品中成功分離一株BVDV毒株，并對該病毒進行了病原學和分子生物學研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料和細胞 從云南省某牛場采集的疑似BVDV感染發(fā)病牛腫大出血的腸系膜淋巴結和脾臟，于滅菌MEM營養(yǎng)液中凍存，低溫運至實驗室；MDBK細胞和Vero細胞由中國微生物菌種保藏管理委員會獸醫(yī)微生物中心提供；綿羊睪丸細胞由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.1.2 毒種與血清 牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)標準毒株Oregon C24V株、BVD標準陽性血清和標準陰性血清，由中國微生物菌種保藏管理委員會獸醫(yī)微生物中心提供。

1.1.3 主要試劑 DMEM營養(yǎng)液為Gibco公司產品；胎牛血清為Hyclone公司產品；Ex-Taq酶為寶生物工程(大連)有限公司產品；Trizol為Invitrogen公司產品；IPTG、X-gal為北京索萊寶科技有限公司；低熔點瓊脂糖、中性紅溶液為Sigma公司；BVDV抗原檢測ELISA試劑盒為IDEXX公司產品；DNA凝膠回收試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司；T載體和感受態(tài)細胞為Tansgen公司；BVDV 間接免疫熒光試劑盒為中國微生物菌種保藏管理委員會獸醫(yī)微生物中心產品；抗藍舌病病毒(BTV)FITC結合熒光抗體為美國VMRD公司。

1.1.4 主要儀器 PCR儀(Biometra)、1500型酶標儀(Thermo)、電泳儀、紫外成像儀、倒置熒光顯微鏡(萊卡)等。

1.2 方法

1.2.1 病料的處理 將腫大出血的腸系膜淋巴結和脾臟混合樣品反復凍融3次，經組織研磨勻漿后，10000 r/min離心15 min，取上清，用孔徑為0.22 μm濾膜過濾除菌，將濾過液-70 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病料的初步檢測 取1.2.1處理好的病料，按IDEXX BVDV抗原檢測ELISA試劑盒進行檢測和判定，檢測結果為BVDV陽性的病料用以病毒分離。

1.2.3 病毒的分離 將經1.2.2檢測結果為BVDV陽性的上清液3.0 mL，接種已長成單層的MDBK細胞培養(yǎng)瓶(75 cm2)，37 ℃吸附1 h，補加含2%胎牛血清的DMEM維持液(慶大霉素200 μg/mL、兩性霉素10 μg/mL)至30.0 mL，置37 ℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱培養(yǎng)5日，每天觀察細胞病變。如此盲傳15代，如未出現細胞病變效應(Cytopathic Effect, CPE)，且經IDEXX牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒抗原檢測試劑盒和RT-PCR檢測結果均為陽性，則視為非致細胞病變型BVDV；如有CPE，則視為致細胞病變型BVDV。

1.2.4 病毒分離株的病毒含量測定 將1.2.3病毒株細胞F15代培養(yǎng)液，用不含血清的DMEM營養(yǎng)液進行10倍系列稀釋，取10-1～10-9九個稀釋度，每個稀釋度接種4孔已長成單層的96孔細胞板，每孔0.1 mL，37 ℃吸附1 h，補加2%胎牛血清的DMEM營養(yǎng)液培養(yǎng)5日，同時設正常細胞對照，采用間接熒光方法判定是否感染，按Reed-Muench法[6]計算TCID50。

1.2.5 純凈性檢測 按照《中國獸藥典》2015年版三部附錄方法分別進行無菌檢驗、支原體檢驗和外源病毒檢驗。

1.2.6 特異性檢測

1.2.6.1 鑒別試驗 將毒種用DMEM營養(yǎng)液稀釋為100 TCID50/0.1 mL，與等量BVDV特異性陽性血清混合，在37 ℃下中和作用1 h后，接種96孔板單層MDBK細胞各8孔，每孔100 μL，同時設立正常細胞對照和病毒對照各8孔。接種后在37 ℃下吸附1 h，再補加含2%新生牛血清的DMEM維持液100 μL，置37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)96 h，采用間接熒光抗體法判定結果。

1.2.6.2 間接熒光抗體檢測 按1.2.4方法培養(yǎng)72 h，棄去培養(yǎng)液，用80%冷丙酮乙醇溶液固定30 min，然后按照BVDV間接熒光試劑盒說明書進行熒光抗體檢測，倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6.3 RT-PCR檢測 根據BVDV國際標準毒株基因序列，在其最保守的5'端非編碼區(qū)序列設計合成一對引物，引物序列如下：

上游引物：5'-CATGCCCATAGT AGGAC-3'；

下游引物：5'-CCATGTGCCATGTACAG-3'。

引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，預期片段為288 bp。

按病毒基因組RNA提取試劑盒說明，從分離毒株的細胞培養(yǎng)液和BVDV標準毒株Oregon C24V株細胞培養(yǎng)物中提取RNA。反轉錄合成cDNA反應體系為：AMV RT 5×Buffer 4 μL、dNTP(各2.5 mmol/L)2.5 μL、RNasin(40 U/μL)1 μL，反轉錄酶(5 U/μL)1 μL、下游引物(25 μmol/L)各1 μL、模板RNA 5 μL，補充DEPC水至20 μL，混勻后瞬離，42 ℃反轉錄60 min。PCR擴增反應體系為：模板cDNA 1 μL，Taq酶(5 U/μL)1 μl，dNTP(各2.5 mmol/L)1 μL，上游引物和下游引物(25 μmol/L)各1 μL，10×Buffer(含Mg2+)2.5 μL，補充DEPC水至25 μL，混勻后瞬離。PCR循環(huán)條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s， 50 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min；最后4 ℃保溫。用1.5%瓊脂糖平板(溴化乙銨終濃度0.5 μg/mL)凝膠電泳檢測PCR擴增結果。

1.2.7 基因型序列測定 將1.2.6.3的 PCR產物目的片段的凝膠塊切下后，按商品化DNA凝膠回收試劑盒說明書進行DNA回收，克隆到pMD18-T載體上，送北京六合華大基因科技股份有限公司進行序列測定，然后與Genbank中已發(fā)表的30株BVDV毒株的5'端非編碼區(qū)序列使用MEGA軟件進行遺傳進化分析。采用的BVDV參考毒株信息見表1。

1.2.8 電鏡形態(tài)觀察 取F15代病毒培養(yǎng)物200 mL，反復凍融三次后10000 r/min離心30 min，取上清液50000 r/min離心5 h，棄上清液，沉淀物用0.5 mL去離子水溶解，用2%磷鎢酸鈉負染30 min，室溫下自然干燥后，在透射電鏡下觀察。

1.2.9 動物回歸試驗 選取BVDV抗原、BVDV 抗體均為陰性(血清中和抗體效價不高于1:4)的牛7頭，分為2組，1組2頭，1組5頭。將分離到的牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒細胞毒(病毒含量為103.0TCID50/mL)接種牛(5頭)，每頭牛接種10.0 mL(滴鼻腔左右各2.0 mL，滴口腔2.0 mL，頸部肌肉左右各注射2.0 mL)。同時設定2頭牛作為健康對照。兩組牛隔離飼養(yǎng)，攻毒后觀察14日，每日飼養(yǎng)、觀察，測定體溫(從攻毒前2日開始測定體溫)并采集深層鼻腔拭子接種MDBK細胞進行病毒分離，攻毒后14日剖殺作病理解剖學觀察。

表1 序列分析用BVDV參考毒株Tab 1 BVDV reference strains for sequence analysis

2 結果與分析

2.1 BVDV的分離 將IDEXX BVDV抗原檢測ELISA試劑盒檢測結果為陽性的腸道樣品接種MDBK細胞連傳15代，均未出現CPE(圖1)。將F1～F15代病毒培養(yǎng)物用IDEXX牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒抗原檢測試劑盒檢測均為陽性。將F15代細胞培養(yǎng)物進行PCR，結果為陽性(見圖2)。

A：BVDV F15代在MDBK上未產生CPE B：MDBK細胞對照A: None CPE appeared on MDBK cell infected with the 15th generation BVDV; B: Normal MDBK control

M：蛋白分子量標準；1: BVDV Oregon C24V株的PCR產物；2: BVDV F15代培養(yǎng)物的PCR產物; 3: MDBK細胞的PCR產物M：Protein Marker；1: PCR result of BVDV strain Oregon C24V;2: PCR result of the 15th generation BVDV;3: PCR result of MDVK cells

2.2 BVDV病毒含量測定 BVDV病毒分離物連傳15代，仍未出現CPE。將第5代病毒培養(yǎng)物收獲、凍融并分裝，經IFA病毒含量測定結果為104.5TCID50/ml。

2.3 純凈性檢測 按照2015年版《中國獸藥典》三部附錄方法進行無菌檢驗、支原體檢驗和外源病毒檢驗，結果為無菌生長、無支原體生長和無外源病毒污染，說明該分離毒株純凈性良好。

2.4 特異性檢驗

2.4.1 鑒別檢驗 將BVDV毒種稀釋為100 TCID50/0.1 mL后與等量BVDV標準陽性血清中和后接種MDBK細胞，經IFA染色未出現特異性熒光，BVDV病毒對照出現特異性熒光，正常細胞對照未出現特異性熒光(圖3)，說明分離的毒株為BVDV。

表2 F5代BVDV毒種外源病毒檢測結果Tab 2 Test of exogenous virus on 5th generation BVDV

A：中和樣品；B：病毒對照；C：細胞對照A: neutralized sample; B: Virus positive control; C: Normal cell control.

2.4.2 熒光抗體檢測 將分離的BVDV培養(yǎng)物在MDBK細胞上培養(yǎng)72小時，然后采用BVDV間接熒光試劑盒進行染色，在感染細胞的胞漿可觀察到典型的綠色熒光(圖4 A)，而細胞對照未出現綠色熒光(圖4 B)。

A：BVDV感染MDBK；B：MDBK對照A: Virus-infected MDBK cell；B: MDBKl cell control.

2.4.3 RT-PCR檢測 用設計的特異性引物，對分離培養(yǎng)物及BVDV Oregon C24V標準毒株進行RT-PCR擴增，發(fā)現分離培養(yǎng)物與BVDV 國際標準毒株Oregon C24V株均能擴增出288 bp的片段(圖5)，與預期目的片段一致，擴增結果清晰，無雜帶，而培養(yǎng)用MDBK細胞無任何條帶。

2.5 基因型序列測定 將所測的目的片段與Genbank中已發(fā)表的30株BVDV序列的5'端非編碼區(qū)序列進行同源性比較，同源性為68.7%～89.2%。其中與我國分離的BJ1202株(登陸號：KF925514.1)和Y2株(登陸號：KY964311.1)同源關系最近，均為89.2%。與BVDV I型經典毒株Oregon株、Singer株、NADL株的同源性為83.8%～86.9%(圖6)，與BVDV 2型經典毒株890株同源性僅為73.4%；與2014年以來我國北京、吉林、四川、山東等地分離的BVDV 毒株親緣關系在88%左右?；蛐蛄邢到y(tǒng)進化樹分析結果顯示同樣的結果(圖7)。

2.6 電鏡形態(tài)觀察 BVDV分離株細胞培養(yǎng)液經離心濃縮，負染，電鏡下觀察發(fā)現，病毒離子略呈圓形，有囊膜，直徑約40～60 nm。

M: 蛋白分子量標準；1: BVDV Oregon C24V株的PCR產物;2: BVDV分離株的PCR產物; 3: MDBK細胞的PCR產物;M: Protein Marker; 1: PCR result of BVDV strain Oregon C24V;2: PCR result of BVDV strain;3: PCR result of MDBK cell.

圖6 BVDV/W株與Genbank中BVDV基因序列進行同源性比較Fig 6 Homology analysis between BVDV/W and the sequences from GenBank

圖7 BVDV W株與Genbank中BVDV基因序列系統(tǒng)進化樹Fig 7 Phylogenetic analysis of BVDV/W and sequences from GenBank

圖8 BVDV/W株電鏡照片Fig 8 The electronic microscope photo of strain BVDV/W.

2.7 動物回歸試驗結果 將BVDV分離毒株接種陰性敏感牛，從臨床觀察癥狀看，攻毒后第3日開始有3頭牛陸續(xù)出現典型的腹瀉癥狀(稀便，嚴重時甚至呈水樣)，3頭牛的口腔、鼻腔、陰道、肛門或眼結膜等黏膜組織出現充血或潰瘍等癥狀，2頭牛的鼻腔或眼睛還伴有黏液性或膿性分泌物，發(fā)病牛精神沉郁、食欲減退；出現腹瀉的3頭牛體溫升高到40 ℃以上，最高可達到41.6 ℃，其中2頭均持續(xù)高溫2日以上。另外的2頭牛體溫未見異常，但伴有漿液性或膿性眼鼻分泌物。1頭牛連續(xù)腹瀉后第10日死亡。對照牛未見任何異常。從攻毒牛鼻拭子病毒分離情況看，攻毒后有3頭牛從攻毒后第5～8日開始向外排毒，可持續(xù)至第10～14日(1頭持續(xù)至14日)，2頭牛僅攻毒后5～6日和5～7日可檢測到病毒。

3 討 論

據可否使培養(yǎng)細胞產生細胞病變，可將BVDV分為兩種生物型[1-2]：一種為病毒在細胞中復制不引起細胞病變，稱為非致細胞病變型(Noncytopathogenic,NCP)，如NY-1株；另一種為引起細胞形成空泡、核固縮、溶解和死亡等病變，稱為致細胞病變型(Cytopathogenic,CP)，如OregonC24V株、NADL株等。NCP型能引起持續(xù)感染，CP型BVDV在體內不能引起持續(xù)感染。從國內外已批準的BVDV弱毒疫苗和滅活疫苗(包括含BVDV 成分的二聯或多聯疫苗)看，僅有4個疫苗為NCP生物型，其余均為CP型[7]。本研究利用MDBK細胞，成功從疑似感染BVDV牛腫大出血的腸系膜淋巴結和脾臟樣品中分離出1株BVDV，該毒株在MDBK細胞上連傳15代，均不產生CPE，證明該分離毒株為NCP型。從動物回歸結果看，該分離毒株接種健康易感牛，可引起體溫升高(超過40 ℃)、腹瀉、黏膜病、眼鼻黏性或膿性分泌物等典型BVD癥狀，從而進一步證明分離到的毒株為BVDV。

BVDV 5'-UTR在BVDV基因組中相對保守的，常用作合成引物來檢測BVDV或作為BVDV分型鑒定引物[8-9]。根據5'-UTR的序列可將BVDV分為BVDV-1和BVDV-2兩種基因型，但這兩種基因型均屬于同一個血清型，存在一定的交叉保護[10-11]。Fei Xue等[12](2010)研究表明：目前我國流行優(yōu)勢株以BVDV-1型為主。本研究根據國際標準毒株的5'-UTR序列設計出特異性引物，經PCR反應可擴增出288bp特異性條帶，并經5'-UTR序列分析，與我國分離的BJ1202株(登陸號：KF925514.1)和Y2株(登陸號：KY964311.1)同源關系最近，均為89.2%，與2014年以來我國北京、吉林、四川、山東等地分離的BVDV毒株親緣關系在88%左右。系統(tǒng)進化樹也顯示分離的毒株與國內主要流行分支相同，均屬于BVDV-1型。說明該毒株具有一定的代表性。

BVD的根除方法是病畜的檢驗與捕殺，但成本較高。疫苗接種是目前多數國家控制和預防該病的主要方法，常規(guī)滅活疫苗和活疫苗是主要的疫苗類型[13]。弱毒疫苗雖可刺激機體產生較高滴度的抗體，但其存在毒力不穩(wěn)定，可誘發(fā)免疫抑制、持續(xù)感染以及可能存在外源病原污染等安全隱患。相比較而言，滅活疫苗安全性方面的優(yōu)勢更為明顯，并且其免疫原性相對較差的缺點可通過選用有效的佐劑加以改進。針對目前BVD較為嚴重的流行形勢，采用流行優(yōu)勢毒株制備安全高效的滅活疫苗應為防控這BVD的首選。 因此，本研究所分離到的BVDV/W株具有開發(fā)滅活疫苗的潛力。