王繼英，趙雪艷，朱曉東，孫厚偉，張 濤，成建國，武 英

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，山東 濟南 250100；2.山東春藤食品有限公司棗莊黑蓋豬保種場，山東 棗莊 277100）

棗莊黑蓋豬（圖1和圖2），俗稱“蓋子豬”，其中心產(chǎn)區(qū)位于棗莊市境內(nèi)，屬華北型優(yōu)良地方豬種，存養(yǎng)歷史悠久。棗莊黑蓋豬具有繁殖率高、哺育力強、肉質(zhì)細嫩、耐粗抗病、對環(huán)境的適應(yīng)力強等特性。無論從育種還是市場開發(fā)方面，棗莊黑蓋豬都具有良好的開發(fā)利用前景。在市場經(jīng)濟的沖擊下，自20世紀80年代開始，大量的國外種豬引入，嚴重影響了山東省地方豬種的純度和種質(zhì)特性的保存，對該豬種進行有效保護已經(jīng)刻不容緩。

圖1 棗莊黑蓋豬公豬

圖2 棗莊黑蓋豬母豬

深入了解豬種的遺傳多樣性、群體結(jié)構(gòu)及其與山東省主要引進豬種之間的遺傳關(guān)系，是開展該地方豬科學(xué)保護、有效利用的基礎(chǔ)。以前主要使用線粒體DNA和微衛(wèi)星標記進行豬種的遺傳變異檢測[1-2]，獲得的遺傳標記數(shù)量非常小，不足以在全基因組范圍闡述品種遺傳特征。隨著基因組芯片和二代測序技術(shù)的普及，開始利用覆蓋基因組范圍的SNP標記在全基因組層面上對豬種進行研究[3-4]、深刻揭示群體遺傳結(jié)構(gòu)，特別是與引進豬種的親緣關(guān)系。

本研究針對棗莊黑蓋豬核心群體，采用SNP芯片在全基因組范圍內(nèi)檢測遺傳變異（SNP），應(yīng)用全基因組范圍內(nèi)的遺傳標記，分析群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，以期深入揭示黑蓋豬與引進豬種之間的遺傳關(guān)系，進而為該品種的保護、分子育種和雜交利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2017年9—12月在山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室進行。

1.2 試驗材料

棗莊黑蓋豬（N=30）采自棗莊黑蓋豬保種場，大約克（N=27）、長白（N=25）、杜洛克（N=30）、巴克夏（N=41）和皮特蘭（N=32）采自山東省外種豬原種場核心群豬群。樣本采集時，選取核心群全部種公豬及有代表性的種豬30頭左右，取耳組織放入eppendorf離心管中，加入70%酒精，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因型測定

利用血液/組織/細胞基因組提取試劑盒（DP304，天根生化科技有限公司）提取試驗豬耳組織的基因組DNA?；蚪MDNA質(zhì)檢合格后委托北京康普森生物技術(shù)有限公司利用Illumina PorcineSNP55 BeadChip芯片進行基因組SNP位點的基因型判型。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 SNP質(zhì)控與篩選 利用Plink軟件[5]進行數(shù)據(jù)質(zhì)量控制，剔除檢出率小于0.95的SNPs，剔除次等位基因頻率（Minor Allele Frequency,MAF）小于0.05的SNP標記。該芯片共包含43 832個SNP，經(jīng)過質(zhì)控篩選后剩余39 300個SNP用于下一步遺傳分析。

1.4.2 群體內(nèi)遺傳多樣性分析 針對群體內(nèi)的遺傳多樣性，利用Plink軟件[5]分析觀察雜合度（HO）、期望雜合度（HE）和群體內(nèi)遺傳距離（Dst）3個指標。

1.4.3 品種遺傳分化分析 將質(zhì)檢篩選后的39 300個SNP的基因型，利用MEGA7軟件[6]，采用最大復(fù)合似然模型（Maximum Composite Likelihood Model）進行群體遺傳距離分析；采用鄰接法（NJ）繪制群體系統(tǒng)進化樹，基于遺傳距離與系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果，研究棗莊黑蓋豬及引進豬的遺傳距離和群體結(jié)構(gòu)。

1.4.4 群體結(jié)構(gòu)分析 利用STRUCTURE軟件[7]，估計群體間共同祖先的比例，分析群體的混雜程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 群體內(nèi)遺傳多樣性

黑蓋豬和5個引進豬群體內(nèi)遺傳多樣性分析結(jié)果詳見表 1。觀察雜合度（HO）、期望雜合度（HE）、群體內(nèi)遺傳距離，這些均為衡量群體內(nèi)遺傳多樣性的指標，這些指標值越大，表明該群體中的基因豐度越大，也就意味著群體的遺傳多樣性越高，某些有利等位基因滅絕的可能性越小。從表1可以看出，黑蓋豬與5個引進豬群體相比，遺傳多樣性各項指標均較高，群體內(nèi)遺傳多樣性最為豐富。

表1 遺傳多樣性參數(shù)估計

2.2 群體間遺傳分化分析

黑蓋豬與5個引進豬群體遺傳距離和凈遺傳距離如表2和表3所示?？梢钥闯?，黑蓋豬與5個引進豬群體的遺傳距離（0.671 2~0.706 7）和凈遺傳距離（0.306 8~0.394 6），5個引進豬種間遺傳距離為0.540 2~0.651 2，凈遺傳距離為0.189 2~0.352 0。本分析結(jié)果表明總體而言，黑蓋豬與引進豬群體存在比較大的遺傳分化。

2.3 群體結(jié)構(gòu)分析

為了能夠定量地分析這些群體的遺傳結(jié)構(gòu)及其混合模式，本研究進一步做了STRUCTURE分析。該分析中把群體的亞群數(shù)稱為K值。預(yù)設(shè)群體亞群數(shù)后，軟件使用貝葉斯算法推算群體是如何形成這些亞群的，以及每個個體的血統(tǒng)構(gòu)成是如何的。由于本研究中包含了棗莊黑蓋豬及5個引進豬種，所以本分析預(yù)設(shè)K=6，即把備檢樣本分成6個亞群。這些亞群在黑蓋豬及5個引進豬種的分布如表4所示。可以看出，黑蓋豬特征亞群為5，所占的比例為0.826，低于5個引進豬種特征亞群所占的比例（0.922~0.996）。

表2 群體間遺傳距離（Evolutionary Divergence）分析結(jié)果

表3 群體間凈遺傳距離（Net Evolutionary Divergence）分析結(jié)果

表4 各群體所占的預(yù)定義亞群的比例（K=6）

圖3為繪制的黑蓋豬和5個引進豬種的STRUCTURE圖。可以看出，6個群體各有其特征性組成，可以單獨分開。其中黑蓋豬中亞群5的比例為0.826。引進豬在黑蓋豬中比例占到0.174，其中杜洛克影響最大（0.068），皮特蘭最?。?.006）。

圖3 棗莊黑蓋豬及5個引進豬種STRUCTURE群體結(jié)構(gòu)

2.4 系統(tǒng)進化樹分析

圖4為利用最大似然法構(gòu)建的黑蓋豬及5個引進豬種的NJ系統(tǒng)發(fā)生樹。可以看出，黑蓋豬在分子系統(tǒng)發(fā)生樹上單獨聚集成一個分支，表明黑蓋豬品種特征明顯，可以單獨聚類在一起。

圖4 棗莊黑蓋豬及5個引進豬種基于鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

3 結(jié)論

棗莊黑蓋豬群體內(nèi)多樣性各項指標均較高，群體內(nèi)遺傳多樣性豐富。棗莊黑蓋豬與5個引進豬種存在大的遺傳分化，棗莊黑蓋豬與巴克夏豬群體遺傳距離和凈遺傳距離最大，與長白豬的遺傳距離和凈遺傳距離最小。群體結(jié)構(gòu)分析表明，棗莊黑蓋豬在系統(tǒng)發(fā)生樹上單獨聚類成一個分支，特征性亞群在群體中所占比例為0.826，故棗莊黑蓋豬具有自己獨特的遺傳特征，是一個受引進豬影響較小的地方豬群體。今后選育中，建議利用分子標記分析結(jié)果，進一步進行選優(yōu)提純，剔除部分可能與引進豬群體混雜的個體，進一步提高本品種特征。