常潔 張瑜 宋浩斌 丑廣程 韓立坡 董青偉 張娣 馬蕾

手足口?。℉FMD）常見致病病毒包括腸道病毒71型（EV71）、柯薩奇A組16型（CoxA16）等，患兒臨床表現(xiàn)以發(fā)熱伴手、足、口等部位皮疹為主，嚴(yán)重者可繼發(fā)心肌炎、神經(jīng)源性肺水腫、無菌性腦膜炎，威脅生命[1]。最新研究發(fā)現(xiàn)，病毒引發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥介質(zhì)大量聚集，是影響患兒預(yù)后質(zhì)量的主要原因[2]，而炎癥反應(yīng)往往伴隨著機(jī)體免疫功能的變化，因此，進(jìn)一步了解HFMD患兒免疫功能變化與疾病進(jìn)展的關(guān)系，有望為臨床病情評(píng)估、預(yù)后預(yù)測及治療對(duì)策的制定提供參考依據(jù)。為證實(shí)這一假設(shè)，本研究選取106例HFMD患兒及40名健康體檢兒童進(jìn)行了對(duì)照分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究方案征得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，納入標(biāo)準(zhǔn)：1）研究對(duì)象為2014年3月至2017年8月，參照《手足口病診療指南（2010年版）》[3]明確診斷的患兒；2）血清學(xué)、腦脊液或咽拭子EV71型核酸檢測陽性；3）近期無免疫增強(qiáng)或抑制藥物使用史，無結(jié)核等其他影響免疫功能的疾病；4）患兒輕型組、重型組分組標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[4]。輕型組59例，其中男31例，女28例，年齡2～7歲，平均（4.27±1.33）歲；重型組47例，其中男25例，女22例，年齡2～8歲，平均（4.18±1.10）歲；對(duì)照組來自同期40名健康體檢兒童，男20名，女20名，年齡2～8歲，平均（4.31±0.99）歲。3組受試兒童性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），具有可比性。受試兒童監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

抽取外周血2 mL，取50 μL混勻全血標(biāo)本與相應(yīng)的熒光標(biāo)記單克隆抗體10 μL混勻，室溫條件下避光孵育15 min，加入250 μL溶血素，振蕩混勻，37℃水浴15 min；加入250 μL PBS緩沖液，振蕩混勻，37℃水浴15 min；加入1 mL PBS緩沖液，振蕩混勻，以1800 r/min離心5 min，棄上清，加入250 μL PBS緩沖液，振蕩混勻后使用FACS Calibur型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）對(duì)其T淋巴細(xì)胞亞群、B淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測[5]。此外，使用酶聯(lián)免疫吸附法[6]測定受試兒童血清免疫球蛋白（Ig）及補(bǔ)體C3、C4。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

對(duì)本臨床研究的所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0進(jìn)行分析，對(duì)比3組T淋巴細(xì)胞亞群、B淋巴細(xì)胞亞群及Ig、補(bǔ)體指標(biāo)（x±s）表示， t檢驗(yàn)，影響患兒預(yù)后因素分析采用多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)模型，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組受試兒童T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平

對(duì)照組、輕型組、重型組外周血CD3+逐漸升高，其CD4+、CD8+、CD4+/CD8+逐漸下降，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 3組受試兒童B淋巴細(xì)胞亞群及Ig、補(bǔ)體表達(dá)水平

對(duì)照組、輕型組、重型組外周血CD19+、IgA、IgM、IgG逐漸升高，其補(bǔ)體C3、C4逐漸下降，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表1 3組受試兒童T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平比較（x±s）

表2 3組受試兒童B淋巴細(xì)胞亞群及Ig、補(bǔ)體表達(dá)水平比較（x±s）

2.3 預(yù)后轉(zhuǎn)歸

106例HFMD患兒中，共有5例病死，病死率為4.72%，均為重型患兒。多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)模型示，隨著C、、IgA、IgM、IgG的升高，以及CD+、CD+、CD+/484CD8+和補(bǔ)體C3、C4的下降，HFMD患兒病死率有所上升（P＜0.05）。見表3。

表3 影響HFMD患兒病死率的多因素Cox模型分析（n/%）

3 討論

HFMD是全球性傳染病[7]。多數(shù)患兒經(jīng)常規(guī)治療后病情可得到有效控制，但也有部分患兒病情嚴(yán)重，病程進(jìn)展較快且病死率較高[8]，加之近年來HFMD尤其是重型HFMD發(fā)生率的升高，越來越多的研究開始關(guān)注HFMD病情評(píng)估與預(yù)后預(yù)測標(biāo)志物的探索[9]。

既往研究認(rèn)為，病毒直接損害是引發(fā)腦干腦炎、肺水腫等嚴(yán)重并發(fā)癥并導(dǎo)致HFMD患兒死亡的主要原因[10]。白細(xì)胞介素-6（IL-6）、干擾素-γ（IFN-γ）等炎癥介質(zhì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的大量釋放，是造成輕型HFMD向重型階段進(jìn)展的重要原因之一[11]。

鑒于炎癥反應(yīng)與免疫功能的密切關(guān)聯(lián)，有理由認(rèn)為HFMD患兒疾病進(jìn)展過程中可能伴隨著免疫功能的顯著變化，為此，本研究就HFMD患兒體液免疫、細(xì)胞免疫功能與病情及轉(zhuǎn)歸的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)較健康兒童，輕型HFMD患兒已發(fā)生體液免疫亢進(jìn)、細(xì)胞免疫抑制狀態(tài)，且隨著病情的進(jìn)展，上述病理生理改變進(jìn)一步加劇。與此同時(shí)，多因素Cox模型亦印證了免疫功能變化對(duì)患兒預(yù)后質(zhì)量的顯著影響。

B淋巴細(xì)胞亞群與體液免疫功能有關(guān)，活化的B淋巴細(xì)胞能夠作為抗原遞呈細(xì)胞向T淋巴細(xì)胞遞呈抗原，活化Th2細(xì)胞通過其分泌的細(xì)胞因子激活B淋巴細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生IgA、IgM、IgG等特異性抗體以介導(dǎo)體液免疫[15]，其中，IgA主要在粘膜局部發(fā)揮抗病毒和局部免疫作用，能夠阻止病毒在粘膜部位的吸附和增殖；IgM在機(jī)體早期防御中扮演著重要角色；IgG與體液免疫中毒素與病毒的中和有關(guān)[16]。同時(shí)，HFMD患兒補(bǔ)體C3、C4表達(dá)水平下降，考慮與補(bǔ)體參與特異性、非特異性免疫應(yīng)答后大量消耗有關(guān)[17]。因此，隨著疾病的進(jìn)展，HFMD患兒體液免疫亢進(jìn)逐漸加劇，此時(shí)抗原-抗體復(fù)合物大量形成并誘發(fā)多種炎癥因子釋放，可能是影響其預(yù)后質(zhì)量的主要原因[18]。

綜上所述，HFMD患兒免疫功能變化特點(diǎn)包括T淋巴細(xì)胞亞型比例失衡以及B淋巴細(xì)胞過度激活，即細(xì)胞免疫抑制與體液免疫亢進(jìn)，且這一變化隨著患兒病情進(jìn)展而加劇，是影響患兒預(yù)后質(zhì)量的重要原因。