沈梅芳 陳亮 李定靜
腸癌是我國常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。相較于高分辨率CT、腸鏡,糞便隱血試驗取材方便且成本低,已成為腸癌高危人群長期隨訪篩查的主要手段[2]。檢測中穩(wěn)定可靠的質(zhì)量控制品(質(zhì)控品)是保證結(jié)果準確性的重要前提,但目前市售糞便隱血試驗質(zhì)控品較少。我院自制了質(zhì)控品,對其穩(wěn)定性與可靠性驗證結(jié)果如下。
貝索糞便隱血試劑組(雙聯(lián)法,試劑批號20160110,珠海貝索公司)。氰化高鐵血紅蛋白標準液(濃度50 g/L,批號:20160416,天津市現(xiàn)代高科技研究院中山研究所),文齊氏液 (批號:20160328,天津市現(xiàn)代高科技研究院中山研究所),島津UV-3600紫外分光光譜儀。
稱取健康人糞便標本50 g,加入1000 mL生理鹽水充分混勻,使用分析純?yōu)V紙過濾后留取上清液,作為糞便質(zhì)控品基液。參照文獻以新鮮全血制備Hb溶液[3]。于糞便質(zhì)控基液內(nèi)定量加入用氰化高鐵Hb法標定的Hb溶液,最終配制成100 mg/L糞便基質(zhì)的隱血試驗質(zhì)控品母液。
取質(zhì)控品母液1 mL,使用生理鹽水梯度稀釋為100 mg/L、50 mg/L、25 mg/L、12.5 mg/L、6.75 mg/L共5個濃度梯度?;瘜W法參照貝索糞便隱血試劑盒說明書檢測隱血,與標準比色板對照,判斷陽性結(jié)果[4]:即刻出現(xiàn)紫蘭色陽性反應(yīng)為4+,10 s內(nèi)出現(xiàn)紫蘭色陽性反應(yīng)為3+,1 min內(nèi)出現(xiàn)紫蘭色陽性反應(yīng)為2+,1~5 min內(nèi)出現(xiàn)紫蘭色陽性反應(yīng)為1+,未見紫蘭色陽性反應(yīng)為-。重復測試5次,以2+陽性反應(yīng)時質(zhì)控品濃度為低值濃度,以4+陽性反應(yīng)時質(zhì)控品濃度為高值濃度[5]。
取質(zhì)控品母液1 mL,使用生理鹽水梯度稀釋為100 mg/L、50 mg/L、25 mg/L、10 mg/L、5 mg/L、2 mg/L、1 mg/L、0.5 mg/L、0.4 mg/L、0.3 mg/L、0.2 mg/L、0.1 mg/L、0.05 mg/L共13個濃度梯度。將各濃度質(zhì)控品加入試管內(nèi),置入隱血免疫試紙條,5 min內(nèi)觀察結(jié)果。對照線為紫紅色,陽性結(jié)果測試線可見紫紅色,陰性結(jié)果測試線不出現(xiàn)紫紅色,陽性程度判斷[6]:測試線顏色較對照線深為4+,測試線顏色與對照線顏色相仿為3+,測試線顏色較對照線略淺為2+,測試線顏色較淡為1+,測試線呈微紅線痕為±。重復測試5次,質(zhì)控品低值濃度判斷方法與化學法相同,以3+陽性反應(yīng)時質(zhì)控品濃度為高值濃度。
將隱血試驗質(zhì)控品母液內(nèi)加入0.02% NaN3作為防腐劑[7],分裝120份,每份1.5 mL于尖底離心管中,密閉后貼上標簽:60份為1組,兩組保存溫度分別為-20℃、4℃;在糞便質(zhì)控基液內(nèi)加入0.02% NaN3防腐劑為陰性對照液,分裝24份,每份1.0于尖底離心管中密閉貼上標簽,12份為1組,兩組保存溫度為-20℃和4℃。分別于密閉后1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月。每月末各取5支質(zhì)控品母液,分別稀釋為化學法、膠體金法低值濃度、高值濃度,同步取1支質(zhì)控品基液做陰性對照試驗,檢測其陽性反應(yīng)級別變化程度,判斷質(zhì)控品穩(wěn)定性。
表1 不同保存溫度下質(zhì)控品穩(wěn)定性檢測結(jié)果
隨著質(zhì)控品濃度的下降,其陽性程度逐漸下降,化學法質(zhì)控品濃度為25 mg/L時,其陽性程度為2+,質(zhì)控品濃度為100 mg/L時,其陽性程度為4+。
膠體金法質(zhì)控品濃度為0.5 mg/L時,其陽性程度為2+,質(zhì)控品濃度為5 mg/L時,其陽性程度為3+。
根據(jù)2.1得出的低值和高值濃度進行檢測,由表1可見4℃保存溫度下,質(zhì)控品化學法穩(wěn)定期為5個月,膠體金法穩(wěn)定期為4個月;-20℃保存溫度下,質(zhì)控品化學法、膠體金法穩(wěn)定期均為12個月。
糞便隱血試驗是當前腸癌早期篩查的有效手段[8-9]。然而,目前化學法、膠體金法糞便隱血試驗均缺乏標準的商業(yè)化質(zhì)控品,室間質(zhì)評中僅存在陰性、陽性兩個水平的質(zhì)控品,均導致隱血試驗的準確性受限[10]。為滿足糞便隱血試驗室內(nèi)質(zhì)控要求,我院采用氰化高鐵Hb定量法精確定量新鮮配置的Hb標準液濃度,并將人體糞便溶液作為糞便溶血質(zhì)控品基液,以期解決隱血試驗質(zhì)控品實用性的問題。
糞便隱血試驗化學法的主要原理為Hb內(nèi)亞鐵血紅素可使過氧化氫釋放新生態(tài)氧,而氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的顏色變化能夠有效指導隱血判斷[11-12]。需要注意的是,有研究顯示,當Hb濃度超過100 mg/L時,隨著濃度的升高,化學法檢測結(jié)果測試區(qū)紫蘭色反應(yīng)條帶可能由深變淺直至陰性,其原因考慮與抗原極度過剩所致競爭抑制有關(guān),這一機制可造成夾心抗原生成量下降、反應(yīng)顯色變淺甚至不顯色,即“鉤狀效應(yīng)”[13]。因此,化學法檢測時質(zhì)控品濃度的合理選擇也是重要環(huán)節(jié)。
NaN3廣泛應(yīng)用于有機合成、污水含氧量測定以及血清防腐[14]。本研究以0.02% NaN3作為防腐劑,用于糞便隱血試驗質(zhì)控品的防腐,結(jié)果顯示,在4℃環(huán)境下保存,質(zhì)控品化學法穩(wěn)定期為5個月,而-20℃環(huán)境下,質(zhì)控品化學法穩(wěn)定期可達12個月,說明低溫保存、避免反復凍融能夠顯著提高質(zhì)控品穩(wěn)定性,與過往研究結(jié)果一致[15-16]。
本研究所選糞便隱血試劑組同時配備化學法和膠體金法試劑。一般而言,膠體金法以試紙條對照線為質(zhì)控標準,但更多的是表明試紙的有效性,而膠體金法隱血試驗的質(zhì)控目的在于降低假陰性結(jié)果的產(chǎn)生[17]。此外,由于抗原的免疫活性會逐漸下降,穩(wěn)定性強的低濃度室內(nèi)質(zhì)控品的配制往往較為困難[18]。本研究配制的低濃度質(zhì)控品濃度為0.5 mg/L,在-20℃保存條件下,膠體金法檢測穩(wěn)定期可達12個月。
需要注意的是,由于實驗室條件有限,本研究對于該質(zhì)控品在實際應(yīng)用過程中涉及的不同試劑體系的系統(tǒng)性偏差問題,以及定性方法人為誤差的統(tǒng)計分析均未做更深入的探討,而上述問題是影響該技術(shù)推廣層面困難的關(guān)鍵所在,值得進一步關(guān)注。